第五章 转录组学

2、zinc finger：真核中比较普遍。 1%的哺乳动物基因编码锌指蛋 白。一个蛋白质内通常有多个 finger的拷贝。
3、TBP：只发现于TATA结合蛋白。
二、转录起始中DNA-蛋白质的相互作用
将DNA转录成RNA的酶称为依赖于DNA的RNA聚合酶。真核生物中有三种： RNA polymeraseI :转录28S、5.8S、18SrRNA的多拷贝 RNA polymeraseII :转录编码蛋白和与RNA加工有关snRNA RNA polymeraseIII:转录其他小分子RNA
三、转录开始的识别序列
A：大肠杆菌的promoter：-35box:5’-TTGACA-3’；-10box:5’-TATAAT-3’ B：真核生物的Promoter构造更为复杂：core promoter
四、转录起始的调控
基因表达的一级调控发生在转录水平，决定特定细胞中特定时间表达哪 些基因，并决定开启的基因表达的相对速度；二级调控包括转录起始后 基因表达途径中的所有步骤，负责调节合成的蛋白的数量，或通过化学 修饰改变蛋白质的性质。
微生物菌种上的应用
9 根据细菌或病毒基因组分析结果进行基因 分型、菌种鉴定及流行病学研究。 9 分析药物作用下病毒基因表达情况，促进 了解药物作用机制及基因功能（HIV-1包膜B 蛋白酶中氨基酸编码序列的多变性与该病毒 抗蛋白酶抑制剂的抗药性有关。
预防医学研究
在预防医学方面，可以使人们尽早地 认识自身潜在的疾病，并实施有效的 防治措施。
生物芯片分析流程
生物芯片技术特征
生物芯片技术对样品的检测是高通量、集 成化、并行化和微型化，具有技术操作简 单，自动化程高，序列数量大，检测效率 高，应用范围广，成本相对低等主要特点
样品制备
Oligo-Chip
8 n or 20 n
cDNA-Chip
< 2,000 n
Genomic Chip
> 50,000 n
所有基因的聚类分析
列：不同基因 行：不同实验 红色：表达增强 绿色：表达减弱 黑色：不变
新基因发现
原理：根据已知基因信息，设计一组寡 核苷酸样品，与待测样品进行杂交，获 得新基因信息（一般用于基因组序列未 测定的生物）。
SNP分析
药物基因组学
由于芯片技术能在基因组的水平上监控基 因是表达，从芯片表达谱中获得的信息很 可能有利于研究药物的作用机制及药物对 基因表达的调节作用。
蛋白芯片(Protein Chips)
A microarray-based high-throughput protein assay method
Chemiluminescence or Fluorescence based detection methods can be used to visualize bound antibodies.
sequencing expression
expression
genomic analysis
点制芯片
175 µm 130 µm 100 µm
96, 384, 864 and 1536 well plates
Capillary pin
芯片载体及结合样品原理
膜、玻璃片、硅片 原理：对载体进行化学修饰，活化试剂EDC、 NHS等通过化学反应在载体表面上键合上活性基团如 氨基、环氧化物、巯基、醛基等，以便与配基相结 合，形成具有生物活性的亲和表面，用于固定蛋白 质、核酸或多肽等。
五、RNA的合成和加工
1、编码RNA和非编码RNA A：编码RNA：mRNA：4%，寿命短：细菌半衰期为2-3分钟 真核2-3小时
酵母6200个基因中：3/4在通常的营养成长期合成 B：非编码RNA：rRNA 80% tRNA
2、RNA前驱体 末端修饰：真核和古细菌：5‘-cap 3’polyA 拼接：内含子除去未拼接的mRNA前驱体为核内异质RNA：hnRNA 切断反应：tRNA rRNA一分子以上合成，切断成熟 化学修饰：ＲＮＡ编辑，新的官能团附加
芯片实验室(Chip Lab)
是在微芯片基础上建立的一种便携式分析系统， 可集成式的完成样品制备、生化反应和结果检测 等三个步骤，包括了所有的分析平台。
2、生物芯片技术
生物芯片技术
生物芯片技术就是将芯片与荧光标记的靶分子 进行化学反应（杂交、免疫反应等），经过激 光扫描后，不同反应强度的标记应荧光将呈现 不同的荧光发射谱征，用激光共聚焦显微扫描 仪或CCD相机收集信号后，经过计算机分析数 据结果，从而获得样品中大量相关基因的遗传 信息。
数据分析
Schaffer R., etc., The Plant Cell 2001, 13:113-123
3、生物芯片应用
¾ 基因表达谱分析 ¾ 基因发现 ¾ SNP检测 ¾ 药物基因组学 ¾ 微生物菌种鉴定、致病机理及抗药性分析 ¾ 预防医学研究
基因表达谱分析
可以对基因表达的个体特 异性、组织特异性、发育 阶段特异性、分化阶段特 异性、病变特异性进行综 合分析，获得基因表达 谱，建立基因调控网络。
1、生物芯片背景
何为生物芯片?
生物芯片是指在一块大小不等（1-2cm2)的
玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶或金属等载体 材料上，以大规模阵列的形式排布了不同的 生物分子（蛋白质或核酸等），形成可与目 的靶分子相互作用，并进行反应的固相表面。
生物芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
生物芯片分类
Biochips DNA Chips Protein Chips Lab Chips
DNA芯片(DNA chip)
DNA芯片技术是指通过微阵列(Microarray)技 术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或 原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其 附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的 DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大 量的基因表达及监测等方面研究的最新革命 性技术。主要包扩表达芯片和基因组芯片。
3、细菌的转录和翻译是偶联的
4、RNA聚合酶Ⅱ参与的真核细胞mRNA的合成
1）、真核和原核细胞的转录在本质上是相似的 2）、真核细胞mRNA必须被加工成成熟的mRNA,包括：
5端加帽：真核mRNA转录起始与 加帽几乎同步进行 3端加poly(A)：真核细胞mRNA合成的终止：多聚腺苷酸化（polyA)
机理：polyA上游10-30bp的polyA附加位点（AAUAAA）； PolyA添加是RNA合成终结的过程之一，RNA的安定和翻译效率。 内含子必须被剪除：内含子的分布基本无规律，但具有一定保守性
转录组分析的EST策略
转录组分析的基因芯片策略
1、生物芯片背景 2、生物芯片技术 3、生物芯片应用
环氧基片
探针制备、标记、杂交
探针：以DNA为例 标记：单色荧光/双色荧光标记
单色：低密度 双色：高密度 常用荧光：Cy3,Cy5, 荧光素等 杂交：
扫描
9 扫描仪机理 共聚焦光学 光电倍增管（PMTs） CCD
9 图像输出格式：Tiff文档 9 杂交信号强弱用数值表示 9 数据的标准化
杂交结果
第五章 转录组学
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本章主要内容
一、基本概念 二、EST策略 三、基因芯片策略
基本概念
一、DNA结合蛋白质的基序
1、HTH(helix-turn-helix motif)：真核和原核细胞的DNA结 合蛋白很多都采用HTH基序。负责打开和关闭基因的表达。 如乳糖阻抑物、同源异型结构域（homeodomain)。