CRISPR-Cas9基因敲除小鼠

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CRISPR-Cas9系统的原理
sgRNA
通过设计sgRNA来确定剪切位点 设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
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target
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Cas9的局限性
• 受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚 胎层面的实验。
• 本实验采用Cre-dependent Rosa26 Cas9 knockin mouse克服了这个局限性。
荧光显示含有 Cre/Cas9的组织中NeuN表 达明显减少，而非转入非 目标的sgRNA则目标蛋白无 影响
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NeuN被破坏的比例十分大
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Indel=insertions(插入) and deletions(删除)
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多数为两个等位基因都被破坏，且其 中多为移码突变。
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• 使得CRISPR-Cas9应用更广泛。
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Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting 矢量图
Rosa26，使转 录可被诱导
荧光蛋白
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转入Cas9后与野生小鼠对比
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神经系统荧光对比
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三种实验测试效果：
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三、腺病毒转入肺
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sgKra s
sgp53
sgLkb Kras同源
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修补
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P53的基因变化
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• 多为移码突变
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Lkb1的基因变化
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• 多为移码突变
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Kras的基因变化
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P53和Lkb1不断被损坏， Kras则被修补变得越发
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有转入目的基因的 小鼠大多细胞目的基 因发生移码突变，目 的基因转录和翻译都 明显下调。
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二、腺病毒转入大脑皮层额叶
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目标基因是NeuN
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目的基因发生的改变
✓ 缺失一位 ✓ 缺失多位 ✓ 插入一位 ✓ 插入多位
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优势
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最终肺中出现肿瘤
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总结
• 事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中， 可以大大扩展Cas9的用途。
• 以后用此方法可以更好的对基因进行修整， 已达成更多的实验，为人类医学和生物学作 出贡献。
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三种转接方法： 纳米粒子、腺病毒转导、 慢病毒转导。 三个系统（器官）： 免疫、神经、肺（癌）。
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一、慢病毒转入树突状细胞
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——转入树突状细胞实验过程
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9பைடு நூலகம்
通过荧光蛋白EGFP可以鉴别 Cas9是否转导成功
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设计了两个剪切位点
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CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling
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CRISPR-Cas9系统的原理
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基 配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合 形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核 酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点 剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA， 可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点 切割。