PCR技术的原理、操作及应用 yu1han

流感病毒核酸提取 2
1、取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊 液或细胞培养液）200ul加在1.5ml Eppendorf管中 2、依次加入350ul RLT液、3.5ulβ-巯基乙醇和70%的乙醇550ul混匀 3、将Rneasy mini spin柱子置于干净的2ml收集管上，将2步骤的混合 液600ul吸出加入柱子中，12，000rpm，离心15秒，弃收集管中的离 心液 4、柱子仍放回收集管上，将2步骤剩余的混合液全部吸到柱子上，12， 000rpm，离心15秒，弃离心液 5、于柱子中加入700ul Wash Buffer RW1液，12，000rpm，离心15秒 6、取一支干净的2ml收集管，将离心后的柱子移到新的收集管上，于 柱子中加入500ul Wash Buffer RPE液，12，000rpm，离心15秒 7、弃收集管中的离心液，再于柱子中加入500ul Wash Buffer RPE液， 13，000-14，000rpm，离心2分钟 8、将柱子移到一干净的1.5ml的eppendrof管上，于柱子中加入2050ul的Rnase-free Water，室温静置1-3分钟 9、12，000rpm，离心1分钟，收集离心液即为提取的病毒RNA，立 即做实验或-20℃以下保存
温 度
94 72
成 条 单 链 性 变 2 形
2
2 的
22
2
4
RT-PCR的原理 的原理
相对于PCR，在开始阶段增加步骤：RNA 是单链到双链的过程。 cDNA合成，
实时荧光定量PCR的原理 1 的原理 实时荧光定量
实时荧光定量PCR技术 (RealTime Quantitative PCR) 是指在 PCR反应体系中加入荧光基团 ，利用荧光信号积累实时监测 整个PCR进程，最后通过标准 曲线对未知模板进行定量分析 的方法。
凝胶电泳缓冲液配方
10×TBE缓冲液(每升) ：Tris107.8g Boric Acid55.0g EDTA(Na2)8.2g 10×TAE缓冲液(每升) ：Tris48.4g 冰乙酸 11.42g 0.5mol/L EDTA 20ml
用电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，按每孔8ulPCR产物 上样至胶中。 100伏电泳30min，紫外观察并拍照记录。
104
103 102 阈值
PCR技术的优点 技术的优点
优点: 特异 敏感 快速、 简便 易自动化等
Leabharlann BaiduCR技术的局限性 技术的局限性
为了构建特定引物，使特定DNA序列的选 择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的 数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的 因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。
RT-PCR反应 3 反应
OneStep RT-PCR反应条件如下： 50℃作用30分钟（逆转录：RNA cDNA） 95℃作用15分钟（使逆转录酶等失活） 94℃变性30秒 55℃退火30秒 72℃延伸30秒 回到第3步，34个循环 72℃作用2分钟 结束
RT-PCR扩增产物检测 1 扩增产物检测
常用的荧光定量PCR试剂： SYBR Green I Taqman水解探针
实时荧光定量PCR的原理 2 的原理 实时荧光定量
基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直 线，这样的直线即基线。 光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是 PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到 达设定的域值时所经历的循环数。 研究表明，各模板的CT值与该模板 的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，CT值越小，反之 亦然。利用已知起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线，其中横坐标代 表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 CT值。因此，只要获得未知样品的 CT值，即可从标准曲线上计算出该 样品的起始拷贝数。
RT-PCR扩增产物检测 2 扩增产物检测
RT-PCR扩增产物检测及结果判定
Real-time RT-PCR的操作 1 的操作
病毒核酸RNA提取：同RT-PCR Real-time RT-PCR：以匹基公司禽流感检测试剂盒为 例，按试剂盒操作说明，25µl反应体系：RT-PCR反 应液 15µl，Taq酶 0.25µl，逆转录酶n/4颗（n为PCR 管数），待检RNA 10µl，加好RNA后400g离心5sec， 将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放 顺序。反应条件为：42℃ 30min；92℃ 3min；92℃ 10sec, 45℃ 30sec 72℃ 1min 5个循环；92℃ 10sec, 60℃ 30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光。
RT-PCR反应 2 反应
1、 分别标记好0.2ml的微量离心管。 在每个管中加入如下内容： 5 ul QIAGEN OneStep RTPCR buffer，5× 1 ul 10mM dNTPs 1 ul Enzyme Mix 0.13ul RNase inhibitor (40U/ul) 14.3ul Rnase-free water 2、 加 1ul 的引物 加 5ul 未知RNA或5 ul 阳性对照 或Rnase-free water作为阴性对照。
Real-time PCR的操作 3 的操作
结果判定 1、质控标准 1.1阴性对照的检测结果为阴性。 1.2阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次 实验视为无效。 2、结果判断 2.1 Ct值无数值的样本为阴性样本。 2.2 Ct值≤30.0的样本为阳性。 2.3Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数 值者为阴性，否则为阳性。
Real-time RT-PCR的操作 2 的操作
结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照 品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准；或可根据仪器噪音 情况进行调整。
基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基 线。 光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信 号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与 该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷 贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始 拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只 要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算 出该样品的起始拷贝数。
PCR技术的操作 1 技术的操作
以流感病毒的RT-PCR和Real-time RT-PCR检测为 例说明PCR技术的操作步骤 主要仪器：PCR仪，Real-time PCR仪，微量移液 器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电 泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。
PCR技术的操作 2 技术的操作
1. 病毒核酸RNA提取 2. RT-PCR反应或者Real-time RT-PCR反应 3. UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果
流感病毒核酸提取 1
试验材料 QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司 的QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作类似) β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol） 70% 乙醇 无菌及DNA,RNA酶的1.5ml 离心管 10µl、20µl、200µl、1000µl加样器和枪头 可调13K微型冷冻离心机 待检流感病毒200µl
试剂盒为QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit （catalog #74104） 注意：试剂盒中的RPE液用前需加44ml 的无水乙醇，使终体积达到55ml。
RT-PCR反应 1 反应
试验材料 QIAGEN One Step RT-PCR Kit （Cat No 210212） RNase inhibitor 40u/µl 上游引物 200ng/µl 下游引物 200ng/µl 扩增H5亚型禽流感病毒的引物 序列为： H5-1: 5’-GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC-3’，H5-3: 5’-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3’ 提取的RNA
实时荧光定量PCR的原理 3 的原理 实时荧光定量
Ct与初始模板的关系
固定循环数后，荧光信号与模 板数成正比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值 时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线 性关系，根据样品的Ct值就可 计算出样品中所含的模板量
Δ Rn 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Cycle 32 34 36 38 40
PCR技术的原理 1 技术的原理
遗传物质： 细胞核 染色体 DNA（脱氧核糖 核酸和磷酸链和碱基构成) 碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋 排列的，碱基序列的长度和排列 的顺序决定了生物的多样性。 比如人类体细胞中共有31亿个碱基对， 按上述的0.1%的差，人和人之间 有3百万个碱基对的差别。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的 DNA分子为模板，以一对分别与 模板互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半 保留复制的机理沿着模板链延伸 直至完成新的DNA合成。
PCR技术的应用 技术的应用
基因克隆、测序和表达等 法医学个体识别和亲子鉴定 遗传性疾病检测、肿瘤诊断、病原体检测 等
基因克隆和表达
DNA指纹技术 1 指纹技术
1984年英国的遗传学家Alec Jeffreys在进 行肌红蛋白的DNA序列研究时，意外发 现非功能DNA（不产生蛋白的DNA）上 重复着一种小片段DNA，这一含15个左 右碱基的DNA片段，在不同个体间重复 的频率及位置有明显的不同，Jeffreys首 先在自己的DNA上进行研究，验证了这 一技术，如果我们有血缘关系，这些不 同会大大缩小。 Jeffreys命名这一技术为DNA指纹技术（DNA finger print）。
PCR技术的原理 2 技术的原理
PCR反应的基本成分 包括7种基本成分：模板 DNA、特异性引物、热 稳定DNA聚合酶、脱氧 核苷三磷酸（dNTP）、 二价阳离子、缓冲液及 一价阳离子 基本反应步骤 ：变性--退 火--延伸 最后通过染料如EB染色 DNA后在紫外灯下显色 检出
PCR技术的原理 3 技术的原理
PCR技术的原理、操作及应用 技术的原理、 技术的原理
湖南省疾病预防控制中心微生物检验科 黄一伟
什么是PCR 什么是
PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶 链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技 术
PCR技术的发展历史 技术的发展历史
1985 关于PCR 的文章首次由美国科学家 Kary Mullis等人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶 （生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到来。 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命 名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。
PCR技术的注意事项 技术的注意事项
防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶 胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗 材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核 酸，液体分装使用等。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等 RT-PCR注意防止RNA降解