实验六 酶联免疫吸附测定法

实验六酶联免疫吸附测定法

摘要：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术

(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，具有操作简便、灵敏性高等优点，是生物化学等领域检验的常规测定方法。本实验采用ELISA间接竞争法对牛奶中鼠抗氯霉素（CAP）进行了检测和分析。

关键词：酶联免疫吸附测定鼠抗氯霉素检测

60 年代初期，Averameas 及Ram 等在不破坏酶的催化活性及免疫球蛋白的免疫活性或

蛋白质结构的前提下，利用特殊的交联剂将辣根过氧化物酶（HRP）与人血清白蛋白（HSA）连接在一起，后来又用酸性磷酸酯酶（AP）与抗体（Ab）结合，这些结合物统称为酶标记

物或酶结合物，被用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定，从此建立了免疫酶技术。1971 年瑞典的Engvall 和荷兰的Van Weeman 等人使抗体与溴化氰激活的纤维素结合或使抗体吸附于聚苯乙烯试管上制成固相免疫吸附剂（固相载体），再与免疫酶技术结合，建立了酶联免疫吸附测定法，用于检测抗体或抗原。1974 年Voller 等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELIS A 操作更方便，易重复，灵敏度可高达ng （10-9g）至pg（10-12g），并且所需仪器设备简单，因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一，原则上ELISA 可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断鉴定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。ELISA 过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。ELISA 常用的测定方法主要有直接法和间接法两种：直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色(其颜色深浅与样本中抗原量成正比)；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白(二抗)，使与特异抗原抗体复合物中的抗体作用，加入酶底物，显色(颜色深浅与样本中抗体量成正比)。ELISA 有许多改良方法, 如夹心法( sandwich ELISA) 、双抗体夹心法( double-antibody sandwich technique) 、竞争法、酶- 抗酶法和均质法(homogeneousELISA) 、生物素- 亲和素放大系统(biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑点- ELISA ( dot-ELISA)等。常用方法大致可分为三类：(a) 测定抗体的间接法；(b)测定抗原的双抗体夹心法；(c) 测定抗原的竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。竞争酶联免疫吸附分析法又可分为直接竞争法和间接竞争法。直接竞争法主要有三步：抗体吸附于固相载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液及酶标记的抗原，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。间接竞争法主要有四步：抗原吸附于固体载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液和抗体，温育后清洗→加入酶标记抗体，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。

影响ELISA 测定结果的因素主要包括以下几点：

(1) 抗原：在ELISA 中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结

果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和

特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。

(2) 固相载体：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测

定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、

聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反

应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板目前已大量应用于ELISA 测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板

对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。

(3) 非特异性反应干扰的排除：除了设置稀释液空白、阳性和阴性参比血清等对照外,可采用包埋、封闭等预处理，如在洗涤液和稀释中加入牛血清白蛋白、明胶或吐温- 20 等，以减少非特异性反应的发生。高选择性的单克隆抗体代替多克隆抗体也是提高ELISA 特异性的另一有效途径。(4) 酶和底物的选择：用于ELISA 标记的酶，主要有辣根过氧化氢酶(HRP) 、碱性磷酸酯酶(AP) 、葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶等，而以HRP 用得较多。酶底物本身要求无色，反应后能稳定呈色。一般HRP 常采用邻苯二胺(产物桔黄色,可稳定呈色数小时) 或邻联甲苯胺作酶底物；AP 常用对硝基苯磷酸盐作酶底物。

3.试剂与器

3.1 试剂

1、抗体：鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体

2、抗原：CAP-BSA

3、酶标记抗体（二抗）：HRP-羊抗鼠

4、样品：鸡蛋。（取10g 鸡蛋加48ml 去离子水搅匀，平均分为2 组，一组加入氯霉素

标准品，使其浓度为10 ng/g。在搅拌下向两组样品中逐滴加入50%高氯酸1ml，4 度振荡提取15min，3000rpm 离心10min，上清液过0.45um 滤膜，后用NaOH 调节pH 为7。）

5、缓冲液：

1）包被液:：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159 克，NaHCO3 0.294 克，蒸馏

水稀释至100 ml）。

2）洗涤及稀释液：0.01mol/L pH7.4 PBST 溶液。（NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O

2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml）。

3）底物溶液：A 液（TMB：20mg+DMSO 10ml+超纯水90ml），B 液（一水合柠檬酸：

2.1g+ 十二水合磷酸氢二钠7.11g+ 0.75%过氧化氢尿素0.64ml，加超纯水至100ml），用时将A、B 液按1：1 比例混合。

4）终止液：2mol/LH2SO4。

3.2 器材

聚苯乙烯微量反应板( 96 孔)，可调式微量吸液器（200uL），八道可调式移液器，培养

皿，小烧杯，隔水式恒温箱，酶联免疫检测仪

4.实验内容和步骤

1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为0.5ug/ml，每孔加100 微升，4℃