大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质
粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电
泳、酶切等进一步鉴定。
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1. 受体菌的培养
1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种
于3-5ml LB液体培养基中,37℃,180rpm振荡培养过夜；
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三. 操作步骤
本 实 验 以 E.coli DH5a 菌 株 为 受 体 细 胞 , 并 用
CaCl2处理,使其处于感受态 ,然后与质粒共保温 ,实现 转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因 (Ampr )，
可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入
质粒，则在含 Amp的培养基上不能生长。能在 Amp
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提高转化效率的几个因素
? 质粒的质量和浓度: 用 于 转 化 的 质 粒 DNA 应 主 要 是 超 螺 旋 态 DNA(cccDNA)。转化效率与外源 DNA的浓度在一定 范围内成正比 ,但当加入的外源 DNA的量过多或体积 过大时 ,转化效率就会降低。 1ng的cccDNA即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下 ,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
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常用的感受态细胞制备方法
RbCl(KCl) 法， CaCl2法，电击感受态制备等 ? RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，
但制备较复杂，不适合实验室用
? 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需
电击仪
? CaCl2法简便易行 ，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用
变 , 成 为 能 允 许 外 源 DNA 分 子 进 入 的 感 受 态 细 胞
(Compenent cells)。
? 进入受体细胞的 DNA分子通过复制 ,表达实现遗传信息的
转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
? 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转
化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。2
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提高转化效率的几个因素
? 试剂的质量: 所用的试剂 , 如 CaCl2 等均需是最高纯度的 (GR. 或 AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处
? 防止杂菌和杂DNA的污染：
整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如
离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有
2）设备
恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超
净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度
计，微量移液枪， eppendorf管等。
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3. 试 剂
? 0.1mol/L的CaCl2 ? LB液体培养基 ? LB固体培养基 ? Amp母液：氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配 成 100mg/ml水溶液, -20℃保存备用
时，可加入占总体积 15％的无菌甘油于 -70℃以下
保存半年，因此 CaCl2法使用更为广泛 .
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CaCl 2 法制备感受态细胞原理
CaCl 2法是以 Mendel 和Higa （1970 ）的发现为基 础，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低 渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物
的试剂都要灭菌 ,且注意防止被其它试剂、 DNA酶或
杂DNA所污染 , 否则均会影响转化效率或杂 DNA的
转入 , 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
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二. 材料，设备及试剂
1）材料 E. coli DH5α菌株； pBS质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） Ampˉ；
实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一. 实验原理
1. 概念 感受态细胞
在自然条件下 ,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，
中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘
附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞
吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基
中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表
型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后
将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，
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转化过程
转化
? 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异
株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (Rˉ,Mˉ),它可
以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
? 受体细胞经过一些特殊方法 (如电击法 ,CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法 )的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改
细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞，称感受态细胞。
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转化
转化 (Transformation) 是将外源 DNA分子引入 受体细胞 ,使之获得新的遗传性状的一种手段 ,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。
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提高转化效率的几个因素
? 细胞生长状态和密度 ? 质粒的质量和浓度 ? 试剂的质量 ? 防止杂菌和杂 DNA的污染
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提高转化效率的几个因素
? 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从 －70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备 感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生 长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。 DH5α 菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同 ),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。