实时荧光定量PCR技术的原理及应用

SYBR Green 法 优缺点
优点
▪对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA
▪使用方便 ----不必设计复杂探针
▪非常灵敏 ▪便宜
缺点
▪ 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性 ▪但可以通过融解曲线的分析， 优化反应条件 ▪ 对引物特异性要求较高
➢Real time PCR 方法2－－－ Taq Man Probe法
实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR )
何谓PCR
▪ 简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特 定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合 成。
▪ 基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的 连锁复制.
PCR的要素
▪ PCR的反应的三个主 要步骤
致使PCR并非一直呈指数 扩增，而最终将进入平台期
Rn (荧光信号)
平台期
线性增长期
指数增长期
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
▪ Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数
C(t) value
Ct值是指达到阈值时的循环数
右图是同一样品重复96次Real Time PCR扩增时的实时监测结果， 从这张图上我们可以看出，尽管平 台期的变化很大，但在扩增曲线的 指数增长区的某一区域，重复性非 常好，这对PCR的定量分析非常 重要。
优点
SYBR Green 1嵌合荧光法
探针法
简单易行，成本较低，无 特异性强，能进行多
需合成特异性探针
重PCR
缺点
对扩增的特异性要求 高； 需要设计特异性探针， 不能进行多重PCR 成本较高；有时探针 设计困难
实时荧光定量PCR 原理-------标准曲线
➢ 绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA
系列稀释
实时荧光定量PCR 原理-------标准曲线
▪ 将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real time PCR，就会按照起始 DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。
▪ 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 ▪ Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出
检测PCR扩增反应中每一
▪ 无法对起始模板准确定量， 个循环扩增产物量的变化。 无法对扩增反应实时检测。 ▪ 通过Ct值和标准曲线的分 析对起始模板进行定量分
析
实时荧光定量PCR原理----------定量原理
▪ 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
▪ 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
如果在扩增曲线的指数增长区
适当位置设定荧光检出界限值，即
阈值，就会得到阈值与扩增曲线
的交点Ct值 Ct值与起始模板数的对数值成
反比关系
同一样品进行96次Real Time PCR扩wk.baidu.com图
实时荧光定量PCR的几种方法介绍
▪ 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green
▪ 特异性荧光标记： 2、TaqMan
标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
▪ 确定未知样品的 C(t)值 ▪ 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
Sample
25
▪ 模板DNA量越多， 荧光达到域值的循 环数越少
▪ Log浓度与循环数 呈线性关系，根据 样品Ct值，就可以 计算出样品中所含 的模板量
• 要被复制的DNA模板 • 界定复制范围两端的
引物 • DNA聚合酶 • 合成的原料及水。
▪ 变性，将双股的DNA加热 后转为单股DNA以做为复 制的模板.
▪ 复性 是令引物于一定的 温度下附着于模板DNA两 端。
▪ 延伸 在DNA聚合酶的作用 下进行引物的延长及另一 股的合成。
▪ 实时荧光定量PCR原理 ▪ 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 ▪ 实时荧光定量技术的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号累积实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法
实时荧光定量PCR 原理----------实时原理
常 规 PCR技术：
实时定量PCR技术：
▪ 对PCR扩增反应的终点产 ▪ 利用荧光信号的变化实时
物进行定量和定性分析。
每扩增一条 DNA分子， 释放一个荧 光信号，可 以在循环过 程中任一点 检测荧光
TaqMan法
优缺点
优点
缺点
▪ 对目标序列的高特异性 ----阴性结果确定
▪ 设计相对简单 ----与目标序列某一区域互
补 ▪ 重复性比较好
▪只适合一个特定的目标 ▪委托公司标记，价格较高 ▪不易找到本底低的探针
两种荧光检测方法的比较
➢Real time PCR 方法１－－－SYBR Green l法
▪ SYBR Green l是一种能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区 域的具有绿色激发波长的染料。
SYBR Green
•SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 •变性时，DNA双链分开，无荧光 •复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧 光，在此阶段采集荧光信号。
与目标序列互补
▪5′端标记有荧光物质 ，如FAM等 ▪3′端标记有荧光淬灭物质 (Quencher, Q) ▪探针完整， 5′端荧光物质受3′端淬灭物质的制约 ,不能检出荧光,R 与 Q分开,荧光物质游离出来，发出荧光 ▪ Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
TaqMan法 －－－工作原理
实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
扩增曲线
PCR扩增曲线呈S形曲线 •随着PCR循环数的增加 •DNA聚合酶的失活 •dNTP和 引物的枯竭 •反应副产物焦磷酸对合成 反应原阻害等
➢ 相对定量中的内标
• 内标通常是β-actin、GAPDH基 因等看家基因.
• 在细胞中的表达量或在基因组 中的拷贝数恒定，受环境因素 影响小.
• 内标定量结果代表了样本中所 含细胞或基因组数量.
➢用于生成标准曲线的样品如何设定？
▪ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ▪ 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ▪ 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 ▪ 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做