高效液相色谱法培训课件 PPT
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离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的 理论与实验方法，流动相用高压泵输送， 采用高效固定相和在线检测等手段发展而 成的分离分析方法 。
与气相色谱法相比具有：适用范围广，样 品预处理简单，分离效率高，流动相选择 范围广，检测方法多为非破坏性的，流出 组分可回收等优点。
量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成；
色谱泵
检测器
废液
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自
检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
水： 去离子水
自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂: 分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
选用适宜的容器
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕
离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography) 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓
度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚 集而成胶束（胶粒）。 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶 束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体 系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系， 在整个色谱体系中又增加了一相，故也被 称为假相色谱（pseudo phase
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统
液相色谱流程图
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
自动进样器
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类：
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
ห้องสมุดไป่ตู้
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um
的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的 理论与实验方法，流动相用高压泵输送， 采用高效固定相和在线检测等手段发展而 成的分离分析方法 。
与气相色谱法相比具有：适用范围广，样 品预处理简单，分离效率高，流动相选择 范围广，检测方法多为非破坏性的，流出 组分可回收等优点。
量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成；
色谱泵
检测器
废液
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自
检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
水： 去离子水
自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂: 分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
选用适宜的容器
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕
离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography) 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓
度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚 集而成胶束（胶粒）。 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶 束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体 系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系， 在整个色谱体系中又增加了一相，故也被 称为假相色谱（pseudo phase
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统
液相色谱流程图
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
自动进样器
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类：
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
ห้องสมุดไป่ตู้
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um
的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：