第10章 微生物与基因工程
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➢ 携带了氨卞青霉素抗性基因（ampR）
➢ 多克隆位点区位于lacZ‘基因中，在此位点上插入外源基因会 导致lacZ‘基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。
.
.
.
质粒的不足
（1）外源DNA≤15kb。 （2）转化效率低，约0.1％的转化率。
.
二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体的优点： （1）遗传背景清楚； （2）容纳外源DNA≤23kb。 （3）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。 缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位
.
.
⑵ 插入一小段多克隆位点区
➢ 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点 的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会 破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和 宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板 上，则形成无色噬菌斑。
.
➢ M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适 于克隆300～400bp的外源DNA片段；
.
M13噬菌体的改造
➢ 野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生 型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。
➢ 在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均 为复制和组装所必需的基因。
➢ 外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对 野生型M13的改造主要在IG区中进行。
.
⑴ 插入β－半乳糖苷酶选择标记
第十章
微生物与基因工程
基因工程技术
➢ 基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿 主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基 因产物，或令生物表现出新的形状。
.
基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，
（Ampr）; ➢ 24单一酶切位点（ Tetr中7个， Ampr中3个）。
.
.
.
.
插入失活筛选转化子
➢ 插入失活：pBR322抗生素抗性基因内有许多单一切点的限
制性位点，可以用来切开分子，插入新的DNA片段，新
DNA片段的插入将导致相应抗性基因的失活，这种现象称
～
➢ 如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，对
类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
.
第一节 基因工程概述
➢ 三项重要技术为基因工程奠定了基础: ➢ 1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶
为基因工程提供了有力的工具； ➢ 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重
➢ 这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中 复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数 的质粒。
.
（3）整合质粒
➢ 含有：来自pBR322的复制起点；氨苄青霉素抗性 基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）。来自 酵母的URA3基因；它既可以作为酵母细胞的选择 标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。
.
一、基因工程基本过程
1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。 2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重
组DNA分子； 3、转化：重组DNA分子导入细胞。 4、扩增该克隆DNA。 5、筛选与鉴定； 6、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。 7. 获得表达产物或转基因动物、转基因植物。
.
.
➢ 这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细 胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合 到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
.
2.真核生物病毒载体
（1）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病 毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等 改造后的衍生物作为基因载体。
（2）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（100kb）； 其次具有高表达效率（25％）；安全，仅感染 无脊椎动物；
于必需基因内。
.
λ噬菌体克隆载体的构建
a、缩短长度 野生型λDNA包装的上限为50.5kb，本身
长度为48.5kb，插入片段至多为2.0kb，如 果将其缩短便能够提高装载量。
.
I 插入型载体
➢ 经改造后的长度为37kb，为包装的下限， 插入片段最大为13.5kb（50.5-37kb）
➢ 由于该类载体重组与否均可包装，因而为 区分组子与非重组子必须携带标记基因。
二、微生物与基因工程关系
一切基因工程操作都离不开微生物 1、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造
而成的。 2、基因工程所用千余种工具酶是从微生物中得到的。 3、微生物细胞是基因克隆的宿主。 4、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。 5、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。 6、模式生物提供基础理论。
四环素是敏感的，但仍能表达氨苄抗性基因。
➢ 筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于
氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到
四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是
目的克隆。
.
.
pUC质粒载体
➢ 一个复制起始位点 ➢ 具有更小的分子量：2.8kb ➢ 更高的拷贝数，每个细胞大约500各拷贝 ➢ 具有多克隆位点MCS区段
的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。 3、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），
以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。
.
目前克隆载体种类
➢ 质粒载体 ➢ λ噬菌体载体 ➢ 柯斯质粒载体 ➢ M13噬菌体载体 ➢ 真核细胞的克隆载体 ➢ 人工染色体
.
一、质粒载体
1、特点： （1）具有独立复制起点； （2）具有较小的相对分子质量。1－200kb，外源DNA≤15kb； （3）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终
➢ 它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因 的单链DNA。因此，它主要被用于制备测序用 单链DNA模板、特异的单链DNA探针，定位诱 变等。
.
表10-1 几类大肠杆菌克隆载体比较
载体类型 克隆外源DNA片段 大小
主要用途
质粒载体
λ噬菌体载 体
柯斯质粒 载体
M13载体
<15kb <23kb
克隆和表达外源基因；DNA 测序
.
第二节 微生物与克隆载体
载体：克隆载体、表达载体、穿梭载体 克隆载体：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适 的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种 以扩增外源DNA为目的载体，称为克隆载体。
.
克隆载体应具备的性质
1、可独立自主复制，具备复制原点； 2、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制
浓度10－20μg/ml的氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主DNA合成终 止，质粒复制正常进行，可达数千个拷贝； （4）具有便于选择的标记； （5）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞； （6）具有安全性。
.
pBR322的结构特征
➢ 环状双链DNA分子，由4361bp组成，松驰型; ➢ colEⅠ复制起点，外源DNA大小为5kb左右; ➢ 四环素抗性基因（Tetr）、氨苄青霉素抗性基因
组成功；1973年Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大 肠杆菌，实现了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先将人工 合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功 地在大肠杆菌中合成得到这14肽； ➢ 1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA 序列的快速测定法；90年代全自动核酸序列测定仪的问世；
➢ 在IG区中插入β–半乳糖苷酶N端一小段编码序列及 其调控序列，该序列编码β–半乳糖苷酶的α肽，α肽 可与大肠杆菌LacZ突变基因 △M15进行α互补，产 生具有活性的β–半乳糖苷酶。
➢ 若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-β-D-半 乳糖苷(IPTG)和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳糖苷(X–gal)培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌 斑。
.
第三节 微生物与基因工程工具酶
常用工具酶种类
内切酶
把DNA长链切割为短的片段
连接酶
将2段DNA片段拼接起来
聚合酶
催化合成形成核酸链
末端转移酶
片段末端加接多聚核苷酸
核酸酶
水解酶，非专一性
反向转录酶
逆转录酶
.
一、限制性内切酶
1、限制性内切酶的定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部 分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸 序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制 性内切酶。
.
λ噬菌体载体的优点
可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌 装载外源DNA的量大（≤23kb） 重组λ-DNA的S载体，粘粒载体）
柯斯质粒是 含有λ-DNA 两端cos区的 质粒
.
柯斯质粒的构建
➢ 由于 λ-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段 顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构 建的重组质 粒，可装载外源DNA（45.5kb)， 它仍可象λ-DNA一样，在体外被包装成有感染 活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的 复制子进行复制。构建基因和cDNA<45kb
构建基因300~400bp制备单链DNA；定位诱变； 噬菌体展示
.
五、真核生物的克隆载体
1.酵母质粒载体 酵母质粒载体都是利用其2μm质粒和其酵母染
色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的。可 分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。 主要有三种：附加体质粒、复制质粒、整合质粒
.
II 取代型载体
➢ 经改造后的长度约为40kb，含两个酶切口，两者 间的距离为14kb，然后用外源DNA片段取代之。 包装下限为37kb，
➢ 这类载体不需要标记基因，因为空载的载体DNA 只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细 胞中去。
.
b 删除重复的酶切口
插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须 是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切 口，多了也不行，而天然的λDNA上有许多重 复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个， 这些多余的酶切口必须被删除
.
（1）附加体质粒 （episomal plasmid）
① 结构：pBR322的复制起点、Ampr（氨苄 青霉素抗性基因）；2μm的复制起点；酵母 选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成 酶基因3）。
② 细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。
.
（2）复制质粒
➢ 含有：来自细菌质粒pBR322的复制起点；氨苄青 霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因 （Tetr）。来自酵母染色体的自主复制序列 （ARS）；作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1 基因（色氨酸合成酶基因1）。
实现了DNA的分子克隆;
1978 Genentech公司---人胰岛素-Βιβλιοθήκη -世界上第一种基因工程蛋白药物
1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获
准使用
1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基
因鱼
.
1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉 1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人
.
.
柯斯质粒的优点
➢ 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体 细胞。可以装载更大的外源DNA片段，可装 载45.5kb。
➢ 携带质粒的选择标记，便于筛选 ➢ 有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。
.
M13噬菌体载体
1、 M13 噬菌体基本特点： （1） M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染
宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体 颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂； （2） M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 ； （3）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿 主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制， 因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA ；
（3）植物病毒载体
.
六、人工染色体
酵母人工染色体（YAC）：能容纳最大外源DNA片段。 1、组成：着丝粒（centromere，CEN）、端粒（telomere，
TEL）、酵母自主复制序列（ARS）、选择性标记（如URA3）。 2、功能：大片段克隆（100万bp），多用于真核生物基因库的载
体。 3、相关：细菌人工染色体（BAC）。
➢ 多克隆位点区位于lacZ‘基因中，在此位点上插入外源基因会 导致lacZ‘基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。
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质粒的不足
（1）外源DNA≤15kb。 （2）转化效率低，约0.1％的转化率。
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二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体的优点： （1）遗传背景清楚； （2）容纳外源DNA≤23kb。 （3）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。 缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位
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⑵ 插入一小段多克隆位点区
➢ 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点 的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会 破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和 宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板 上，则形成无色噬菌斑。
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➢ M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适 于克隆300～400bp的外源DNA片段；
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M13噬菌体的改造
➢ 野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生 型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。
➢ 在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均 为复制和组装所必需的基因。
➢ 外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对 野生型M13的改造主要在IG区中进行。
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⑴ 插入β－半乳糖苷酶选择标记
第十章
微生物与基因工程
基因工程技术
➢ 基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿 主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基 因产物，或令生物表现出新的形状。
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基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，
（Ampr）; ➢ 24单一酶切位点（ Tetr中7个， Ampr中3个）。
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插入失活筛选转化子
➢ 插入失活：pBR322抗生素抗性基因内有许多单一切点的限
制性位点，可以用来切开分子，插入新的DNA片段，新
DNA片段的插入将导致相应抗性基因的失活，这种现象称
～
➢ 如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，对
类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
.
第一节 基因工程概述
➢ 三项重要技术为基因工程奠定了基础: ➢ 1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶
为基因工程提供了有力的工具； ➢ 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重
➢ 这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中 复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数 的质粒。
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（3）整合质粒
➢ 含有：来自pBR322的复制起点；氨苄青霉素抗性 基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）。来自 酵母的URA3基因；它既可以作为酵母细胞的选择 标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。
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一、基因工程基本过程
1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。 2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重
组DNA分子； 3、转化：重组DNA分子导入细胞。 4、扩增该克隆DNA。 5、筛选与鉴定； 6、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。 7. 获得表达产物或转基因动物、转基因植物。
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➢ 这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细 胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合 到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
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2.真核生物病毒载体
（1）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病 毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等 改造后的衍生物作为基因载体。
（2）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（100kb）； 其次具有高表达效率（25％）；安全，仅感染 无脊椎动物；
于必需基因内。
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λ噬菌体克隆载体的构建
a、缩短长度 野生型λDNA包装的上限为50.5kb，本身
长度为48.5kb，插入片段至多为2.0kb，如 果将其缩短便能够提高装载量。
.
I 插入型载体
➢ 经改造后的长度为37kb，为包装的下限， 插入片段最大为13.5kb（50.5-37kb）
➢ 由于该类载体重组与否均可包装，因而为 区分组子与非重组子必须携带标记基因。
二、微生物与基因工程关系
一切基因工程操作都离不开微生物 1、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造
而成的。 2、基因工程所用千余种工具酶是从微生物中得到的。 3、微生物细胞是基因克隆的宿主。 4、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。 5、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。 6、模式生物提供基础理论。
四环素是敏感的，但仍能表达氨苄抗性基因。
➢ 筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于
氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到
四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是
目的克隆。
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pUC质粒载体
➢ 一个复制起始位点 ➢ 具有更小的分子量：2.8kb ➢ 更高的拷贝数，每个细胞大约500各拷贝 ➢ 具有多克隆位点MCS区段
的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。 3、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），
以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。
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目前克隆载体种类
➢ 质粒载体 ➢ λ噬菌体载体 ➢ 柯斯质粒载体 ➢ M13噬菌体载体 ➢ 真核细胞的克隆载体 ➢ 人工染色体
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一、质粒载体
1、特点： （1）具有独立复制起点； （2）具有较小的相对分子质量。1－200kb，外源DNA≤15kb； （3）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终
➢ 它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因 的单链DNA。因此，它主要被用于制备测序用 单链DNA模板、特异的单链DNA探针，定位诱 变等。
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表10-1 几类大肠杆菌克隆载体比较
载体类型 克隆外源DNA片段 大小
主要用途
质粒载体
λ噬菌体载 体
柯斯质粒 载体
M13载体
<15kb <23kb
克隆和表达外源基因；DNA 测序
.
第二节 微生物与克隆载体
载体：克隆载体、表达载体、穿梭载体 克隆载体：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适 的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种 以扩增外源DNA为目的载体，称为克隆载体。
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克隆载体应具备的性质
1、可独立自主复制，具备复制原点； 2、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制
浓度10－20μg/ml的氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主DNA合成终 止，质粒复制正常进行，可达数千个拷贝； （4）具有便于选择的标记； （5）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞； （6）具有安全性。
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pBR322的结构特征
➢ 环状双链DNA分子，由4361bp组成，松驰型; ➢ colEⅠ复制起点，外源DNA大小为5kb左右; ➢ 四环素抗性基因（Tetr）、氨苄青霉素抗性基因
组成功；1973年Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大 肠杆菌，实现了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先将人工 合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功 地在大肠杆菌中合成得到这14肽； ➢ 1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA 序列的快速测定法；90年代全自动核酸序列测定仪的问世；
➢ 在IG区中插入β–半乳糖苷酶N端一小段编码序列及 其调控序列，该序列编码β–半乳糖苷酶的α肽，α肽 可与大肠杆菌LacZ突变基因 △M15进行α互补，产 生具有活性的β–半乳糖苷酶。
➢ 若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-β-D-半 乳糖苷(IPTG)和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳糖苷(X–gal)培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌 斑。
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第三节 微生物与基因工程工具酶
常用工具酶种类
内切酶
把DNA长链切割为短的片段
连接酶
将2段DNA片段拼接起来
聚合酶
催化合成形成核酸链
末端转移酶
片段末端加接多聚核苷酸
核酸酶
水解酶，非专一性
反向转录酶
逆转录酶
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一、限制性内切酶
1、限制性内切酶的定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部 分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸 序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制 性内切酶。
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λ噬菌体载体的优点
可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌 装载外源DNA的量大（≤23kb） 重组λ-DNA的S载体，粘粒载体）
柯斯质粒是 含有λ-DNA 两端cos区的 质粒
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柯斯质粒的构建
➢ 由于 λ-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段 顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构 建的重组质 粒，可装载外源DNA（45.5kb)， 它仍可象λ-DNA一样，在体外被包装成有感染 活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的 复制子进行复制。构建基因和cDNA<45kb
构建基因300~400bp制备单链DNA；定位诱变； 噬菌体展示
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五、真核生物的克隆载体
1.酵母质粒载体 酵母质粒载体都是利用其2μm质粒和其酵母染
色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的。可 分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。 主要有三种：附加体质粒、复制质粒、整合质粒
.
II 取代型载体
➢ 经改造后的长度约为40kb，含两个酶切口，两者 间的距离为14kb，然后用外源DNA片段取代之。 包装下限为37kb，
➢ 这类载体不需要标记基因，因为空载的载体DNA 只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细 胞中去。
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b 删除重复的酶切口
插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须 是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切 口，多了也不行，而天然的λDNA上有许多重 复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个， 这些多余的酶切口必须被删除
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（1）附加体质粒 （episomal plasmid）
① 结构：pBR322的复制起点、Ampr（氨苄 青霉素抗性基因）；2μm的复制起点；酵母 选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成 酶基因3）。
② 细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。
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（2）复制质粒
➢ 含有：来自细菌质粒pBR322的复制起点；氨苄青 霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因 （Tetr）。来自酵母染色体的自主复制序列 （ARS）；作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1 基因（色氨酸合成酶基因1）。
实现了DNA的分子克隆;
1978 Genentech公司---人胰岛素-Βιβλιοθήκη -世界上第一种基因工程蛋白药物
1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获
准使用
1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基
因鱼
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1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉 1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人
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柯斯质粒的优点
➢ 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体 细胞。可以装载更大的外源DNA片段，可装 载45.5kb。
➢ 携带质粒的选择标记，便于筛选 ➢ 有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。
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M13噬菌体载体
1、 M13 噬菌体基本特点： （1） M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染
宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体 颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂； （2） M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 ； （3）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿 主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制， 因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA ；
（3）植物病毒载体
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六、人工染色体
酵母人工染色体（YAC）：能容纳最大外源DNA片段。 1、组成：着丝粒（centromere，CEN）、端粒（telomere，
TEL）、酵母自主复制序列（ARS）、选择性标记（如URA3）。 2、功能：大片段克隆（100万bp），多用于真核生物基因库的载
体。 3、相关：细菌人工染色体（BAC）。