甘油冷冻保藏法以及一些注意事项

甘油冷冻保藏法以及一些注意事项

本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。

（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。

（2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。（3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL（LB）的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。

（4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。

（5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。

实验需要预准备的材料：

平皿培养基50％甘油母液，1.5刻度离心管（保存菌种用，最好买进口的，质量较好）注意事项：

（1）50％甘油母液要多灭几次，因为甘油对细菌有很好的保护作用，所以灭菌除杂时也就相对难一点，多灭几次可解决。

（2）平皿要提前灭好培养基倒进去后要计算好过一周附近再涂平板，因为冷却不久的平板积水汽比较多，不利用涂布弄干。放几天可减少水分，利于涂布，不过放太久平皿也会干掉的哦！

（3）最后的甘油浓度一般15～30％，太多不容易冻上，而且如有质粒也有可能丢（有质粒时甘油浓度尽量低一些），