第4章基因工程的主要技术及其原理.pptx
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真核生物RNA分子主要存在于细胞核与细胞质中。 总RNA：rRNA，tRNA，mRNA。其中mRNA仅占总RNA的1％- 5% ，
分子大小不等，由几百乃至数万核苷酸组成。
能否成功提取RNA，关键在于能否完全抑制或除去RNA酶的破坏作用， 获取完整的全长RNA分子。
RNA酶有一条多肽链组成，不需要任何辅助因子，存在十分广泛并十分稳定， 非常耐热，在较宽的pH范围内有活性，及其顽固。
水溶液中，室温10分钟后，再用0.1%DEPC水彻底冲洗。
提取RNA的方法一般包括4个关键点：
1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底； 2) 使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中；
变性剂有异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠等； 3) 有效地抑制内源及外源RNase活性； 4) 将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开。策略一是先提总核酸，再用氯化锂将RNA
第四章 基因工程的主要技术及其原理
第一节 DNA和RNA的提取与纯化
一 DNA提取的基本原理与方法
（一）DNA提取的基本原理
DNA的性质：
1) DNA是极性化合物，不溶于有机溶剂，溶于水，在水中溶解度达 10g/L，其钠盐比游离态更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中 性或弱碱性溶液中较稳定。
2) DNA与核蛋白复合体DNP在在低盐浓度（0.1mol/L NaCl）溶液中 溶解度最低（为水中的1%），在高盐浓度（1mol/L NaCl）溶液中 溶解度较高（为水中的2倍），而核糖核蛋白RNP受盐浓度影响较 小，在低盐浓度中溶解度仍较大。从而可将DNP和RNP分开。
4. 苯酚抽提法 原理：苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚处理细胞匀浆液，
蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，离心分层取水相，多次重复，合并水相， 用乙醇沉淀，即得到DNA。
5. 水抽提法 原理：利用核酸溶于水的性质，用低盐除去RNA，将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解，
离心后收集上清液，加入固体NaCl调至2.6mol/L，加入2倍体积的95%乙醇， 然后，分别用66%，80%，95%乙醇及丙酮清洗DNA，经干燥后即得DNA样品。
提取RNA的实验必须采取以下措施：
1）所有玻璃器皿应置于180℃烘箱烘烤4小时以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制 品需用01%的DEPC（二乙基焦碳酸盐）溶液处理，然后121 ℃高压消毒40分钟；
2) 全部过程需戴手套、口罩操作，并经常更换手套； 3) RNA电泳漕需用去污剂洗涤，用水冲洗干净后，用乙醇干燥，浸泡于3%的H2O2
苯酚-氯仿: 对蛋白质具有极强的变性作用，而对DNA无影响。 RNA杂质: 用不含DNA酶的RNA酶去除。
(3). DNA的沉淀与纯化 溶解在上清液中的DNA加入2倍体积的无水乙醇使其沉淀。 在多糖、蛋白含量高时用1倍的异丙醇沉淀效果较好。
（二）DNA提取的几种方法
根据细胞破碎后，分离DNA与蛋白质所采用的技术策略和试剂不同，可分以 下几种方法： 1. 浓盐法 原理：根据RNP和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。
提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（1mol/L NaCl）将DNP抽 提出来，再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。 DNA提取的步骤： (1). 细胞裂解和DNA的溶解； 一般采用机械破碎或酶解细胞释放DNA，严防细胞中各种酶对DNA的 破坏： 1)利用液氮在超低温下研磨，使酶失活； 2)快速加入缓冲液并迅速混匀，保护DNA。
2. SDS法 原理：SDS使细胞膜裂解，使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA分开，
加入乙酸钾可使SDS-蛋白复合物转变成溶解度更小的钾盐，使沉淀更加完全。
3. CTAB法 原理：在细胞裂解液中，加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来。再经氯仿-异戊醇
抽提除蛋白，即可得到含DNA水相，经乙醇或异丙醇沉淀即得到DNA。
（三）质粒的提取
碱裂解法提质粒DNA的原理：
在强碱环境中，大分子量的核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍 为自然状态。将pH调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形 成不溶性网状结构，但质粒DNA仍然呈可溶状态。
二 RNA提取的基本原理与方法
（一）总RNA提取的基本原理与方法
1. 总RNA提取的原理
CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵，可溶解细胞膜，，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl） 与DNA结合形成复合物并呈溶解状态，但当浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，DNA即从溶液中沉淀，通过离心可将DNA-CTAB复合物与多糖与 蛋白质分开。
SDS: 十二烷基硫酸钠，可使蛋白质变性，核Hale Waihona Puke Baidu白解聚，使DNA游离出来， 再根据DNA和蛋白质在有机溶剂中溶解度差异，用苯酚-氯仿抽提蛋白。
方法1：用1mol/L NaCl抽提，得到的DNP液中加入含辛醇的氯仿，离心，DNA位于 上层水相，回收水相，用2倍体积的95%乙醇或无水乙醇将DNA沉淀出来。
方法2：用0.15mol/L NaCl反复洗涤细胞裂解液除去RNP，再用1mol/L NaCl抽提DNP， 然后用氯仿-异戊醇除去蛋白。
以稀盐溶液提取DNA，可加入适量SDS使蛋白质变性解聚，使DNA解离； 使用SSC溶液（ 5mol/L NaCl、0.015mol/L柠檬酸钠）抑制DNase降解DNA
沉淀出来；策略二是直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，低pH的酚将使RNA进 入水相，而蛋白质和DNA留在有机相中，水相中的RNA可用异丙醇沉淀出来。
2. 总RNA提取的方法
(1) 酚-异硫氰酸胍提取法。 Trizol试剂是最广泛的抽提总RNA的试剂，即根据酚-异硫氰酸胍提取法设计。
EDTA：螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+，降低DNA酶活性； SDS：变性并降解蛋白质，降低DNA酶活性； 抗氧化剂：PVP，β-巯基乙醇，抗坏血酸、半胱氨酸，DTT降低酚类氧化
对DNA的干扰 PVP：有效去除酚类和多糖物质。
(2). 与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除； 主要利用DNA与蛋白、多糖性质不同，加入离子变性剂、去污剂使其变性解聚；
分子大小不等，由几百乃至数万核苷酸组成。
能否成功提取RNA，关键在于能否完全抑制或除去RNA酶的破坏作用， 获取完整的全长RNA分子。
RNA酶有一条多肽链组成，不需要任何辅助因子，存在十分广泛并十分稳定， 非常耐热，在较宽的pH范围内有活性，及其顽固。
水溶液中，室温10分钟后，再用0.1%DEPC水彻底冲洗。
提取RNA的方法一般包括4个关键点：
1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底； 2) 使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中；
变性剂有异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠等； 3) 有效地抑制内源及外源RNase活性； 4) 将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开。策略一是先提总核酸，再用氯化锂将RNA
第四章 基因工程的主要技术及其原理
第一节 DNA和RNA的提取与纯化
一 DNA提取的基本原理与方法
（一）DNA提取的基本原理
DNA的性质：
1) DNA是极性化合物，不溶于有机溶剂，溶于水，在水中溶解度达 10g/L，其钠盐比游离态更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中 性或弱碱性溶液中较稳定。
2) DNA与核蛋白复合体DNP在在低盐浓度（0.1mol/L NaCl）溶液中 溶解度最低（为水中的1%），在高盐浓度（1mol/L NaCl）溶液中 溶解度较高（为水中的2倍），而核糖核蛋白RNP受盐浓度影响较 小，在低盐浓度中溶解度仍较大。从而可将DNP和RNP分开。
4. 苯酚抽提法 原理：苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚处理细胞匀浆液，
蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，离心分层取水相，多次重复，合并水相， 用乙醇沉淀，即得到DNA。
5. 水抽提法 原理：利用核酸溶于水的性质，用低盐除去RNA，将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解，
离心后收集上清液，加入固体NaCl调至2.6mol/L，加入2倍体积的95%乙醇， 然后，分别用66%，80%，95%乙醇及丙酮清洗DNA，经干燥后即得DNA样品。
提取RNA的实验必须采取以下措施：
1）所有玻璃器皿应置于180℃烘箱烘烤4小时以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制 品需用01%的DEPC（二乙基焦碳酸盐）溶液处理，然后121 ℃高压消毒40分钟；
2) 全部过程需戴手套、口罩操作，并经常更换手套； 3) RNA电泳漕需用去污剂洗涤，用水冲洗干净后，用乙醇干燥，浸泡于3%的H2O2
苯酚-氯仿: 对蛋白质具有极强的变性作用，而对DNA无影响。 RNA杂质: 用不含DNA酶的RNA酶去除。
(3). DNA的沉淀与纯化 溶解在上清液中的DNA加入2倍体积的无水乙醇使其沉淀。 在多糖、蛋白含量高时用1倍的异丙醇沉淀效果较好。
（二）DNA提取的几种方法
根据细胞破碎后，分离DNA与蛋白质所采用的技术策略和试剂不同，可分以 下几种方法： 1. 浓盐法 原理：根据RNP和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。
提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（1mol/L NaCl）将DNP抽 提出来，再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。 DNA提取的步骤： (1). 细胞裂解和DNA的溶解； 一般采用机械破碎或酶解细胞释放DNA，严防细胞中各种酶对DNA的 破坏： 1)利用液氮在超低温下研磨，使酶失活； 2)快速加入缓冲液并迅速混匀，保护DNA。
2. SDS法 原理：SDS使细胞膜裂解，使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA分开，
加入乙酸钾可使SDS-蛋白复合物转变成溶解度更小的钾盐，使沉淀更加完全。
3. CTAB法 原理：在细胞裂解液中，加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来。再经氯仿-异戊醇
抽提除蛋白，即可得到含DNA水相，经乙醇或异丙醇沉淀即得到DNA。
（三）质粒的提取
碱裂解法提质粒DNA的原理：
在强碱环境中，大分子量的核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍 为自然状态。将pH调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形 成不溶性网状结构，但质粒DNA仍然呈可溶状态。
二 RNA提取的基本原理与方法
（一）总RNA提取的基本原理与方法
1. 总RNA提取的原理
CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵，可溶解细胞膜，，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl） 与DNA结合形成复合物并呈溶解状态，但当浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，DNA即从溶液中沉淀，通过离心可将DNA-CTAB复合物与多糖与 蛋白质分开。
SDS: 十二烷基硫酸钠，可使蛋白质变性，核Hale Waihona Puke Baidu白解聚，使DNA游离出来， 再根据DNA和蛋白质在有机溶剂中溶解度差异，用苯酚-氯仿抽提蛋白。
方法1：用1mol/L NaCl抽提，得到的DNP液中加入含辛醇的氯仿，离心，DNA位于 上层水相，回收水相，用2倍体积的95%乙醇或无水乙醇将DNA沉淀出来。
方法2：用0.15mol/L NaCl反复洗涤细胞裂解液除去RNP，再用1mol/L NaCl抽提DNP， 然后用氯仿-异戊醇除去蛋白。
以稀盐溶液提取DNA，可加入适量SDS使蛋白质变性解聚，使DNA解离； 使用SSC溶液（ 5mol/L NaCl、0.015mol/L柠檬酸钠）抑制DNase降解DNA
沉淀出来；策略二是直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，低pH的酚将使RNA进 入水相，而蛋白质和DNA留在有机相中，水相中的RNA可用异丙醇沉淀出来。
2. 总RNA提取的方法
(1) 酚-异硫氰酸胍提取法。 Trizol试剂是最广泛的抽提总RNA的试剂，即根据酚-异硫氰酸胍提取法设计。
EDTA：螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+，降低DNA酶活性； SDS：变性并降解蛋白质，降低DNA酶活性； 抗氧化剂：PVP，β-巯基乙醇，抗坏血酸、半胱氨酸，DTT降低酚类氧化
对DNA的干扰 PVP：有效去除酚类和多糖物质。
(2). 与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除； 主要利用DNA与蛋白、多糖性质不同，加入离子变性剂、去污剂使其变性解聚；