第8章 微生物菌种的筛选及鉴定

实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选
文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌
采样（造纸厂） →80℃30min处理 ↓
0.0075% 曲利本蓝＋1% CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4d，选择有凹陷圈的菌落
从285个土样中获得62株
26株为组成型 36株为诱导型
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2.2.3纯种分离
诱变育种/基因重组育种 ▪ 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育 ▪ 从自然界中分离菌种
从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源 中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。
从自然界中分离筛选菌种的一般步骤
设计方案→采样→增殖培养*→平板分 离 →筛选（初筛、复筛）→单株纯种分离 →性能考察（生产性能试验、毒性试验、 菌种鉴定）
培养条件可同初筛
分析测定：定量，注意副产物
复筛可进行多次，逐步淘汰，留下3~5株 甚至最好的1株
初筛和复筛的比较
初筛
复筛
种 子 斜面菌种
液体种子
摇 瓶 每株 1瓶
每 株 3-5 瓶
接 种 量 每瓶一环
3— 5%
取 舍 情 况 留 下 产 量 较 高 的 10- 每 次 保 留 10— 20% ，
琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌
▪ 适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育
（5）抑制圈
▪ 适用：抗生素产生菌的选育
工具菌：对目的抗生素敏感的微生物
例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株
▪ 工具菌可使用金黄色葡萄球菌
▪ 方法
➢ 目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落
➢ 代谢物积累：用打孔器（6MM）将菌落连同周围琼脂 培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养45d，使新产生抗生素积累于小琼脂块中
▪ 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得 纯培养
1 纯种分离的一般方法 ▪ 稀释平板法 倾注平板或涂布平板 ▪ 划线法
稀 释 分 离 涂 布 平 板
稀 释 分 离 倾 注 平 板
划线分离
（3）组织培养法 适用于分离高等真菌及植物病原菌
高等真菌：如香菇→切1小块菌盖 →10%漂白粉消毒处理→无菌水冲洗 →置琼脂平板上→培养→长出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌：
2.2.1采样 从自然界种采集含目的菌的样品
1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响
（1）营养环境 ①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土
壤中：耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生 菌；
②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产 生菌；
③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；
④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中： 蛋白酶产生菌；
德氏乳杆菌
Steptococcus lactis
乳链球菌
Clostridium acetobutylcum
丙酮丁醇梭菌
Corynebacterum pekinese
北京棒杆菌
Brevibacterium ammoniagenes 产氨短杆菌
常见工业微生物及其产物
细菌 短杆菌：谷氨酸、肌苷酸 枯草芽孢杆菌：淀粉酶、蛋白酶、核糖 大肠杆菌：酰胺酶 节杆菌：强的松 梭状杆菌：丙酮、丁醇
第8章 食品微生物菌种的筛选及鉴定
主 讲 惠 明 博士
本节要点
▪ 食品工业上典型的微生物菌种 ▪ 微生物菌种的分离筛选及鉴定 ▪ 微生物菌种的发酵条件优化
一、典型工业微生物菌种
细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌 酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵
母，假丝酵母 霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲霉，
霉菌分生孢子
Saccharomyces cerevisiae Bacillus subtilis B53
NATTO
BEER
二、食品工业微生物菌种的来源
工业上对生产菌种的基本要求 从自然界中分离目的菌种的原则 菌种选育的一般方法
2.1 对工业微生物菌种的基本要求
▪ 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地 合成产物
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培养基配方的获得
单因素试验 多因素试验（正交试验） 回归试验 最佳配方的验证 整个发酵条件的优化
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举例 碳氮源对Bacillus subtilis发酵产PGA的影响
基 本 发 酵 培 养 基 ： L-Glu 20g/L，CTA 10g/L， NH4Cl 4g/L，MgSO4•7H2O 0.5g/L，FeCl3•6H2O 0.02g/L，K2HPO4 1g/L，CaCl2•2H2O 0.2g/L， MnSO4•H2O 0.05g/L, 蒸馏水配制，用NaOH调pH7.4， 0.1MPa灭菌20min。
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举例：产PGA芽孢杆菌的鉴定
细胞形态特征
菌体大小 芽孢形状 芽孢着生位置 G+或G-等
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生理生化特征
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2.2.6 培养工艺条件试验与生产试验
1、摇瓶发酵条件
培养基组成，初始pH，通风量（装液量）， 接种量，培养温度…
2、小型台式发酵罐发酵工艺条件
溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式， 消泡剂…
（3）控制培养温度
➢ 30℃左右培养，可培殖嗜温微生物
➢ 50~60℃培养，可培殖嗜热微生物， 筛选耐热菌株
（4）热处理——增殖芽孢细菌
样品悬浮液经80℃、10min处理，杀 死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽 孢细菌
（5）添加抑制剂
➢ 10%苯酚数滴：抑制细菌、霉菌生长，增殖放 线菌
➢ 多粘菌素B：抑制G-细菌 ➢ 青霉素：抑制G+细菌 ➢ 制霉菌素：抑制真菌 ➢ 放线菌酮：抑制真菌
▪ 淀粉平板透明圈：淀粉酶
▪ 碳酸钙平板透明圈：产酸 ▪ 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶
以大肠杆菌E. coli ATCC 80739为指示菌，对 枯草芽孢杆菌R21-4进行紫外诱变，筛选得 到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆菌 R21-15，抗菌蛋白的效价提高58.49%。
粗提蛋白对棉花黄、枯萎病菌的抑制作用
⑤油田土：石油分解菌 ；
（2）水分 ①取离地表5-15cm的土样 ②含水过多、过少都不理想
（3）温度：采样以秋季为好 （4）通风 （5）酸碱度：
细菌、放线菌：中性或偏碱； 霉菌、酵母：偏酸
2. 采样方法
（1）去除表层土 （2）取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋
或逆料袋中
3. 注意
▪ 记录：时间，地点，环境情况等 ▪ 样品袋应封好口，防止水分失去 ▪ 土样应在分离前破碎 ▪ 尽快分离
➢ 测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放 于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗 生素，大小说明抗生素单位的高低
琼 脂 块 培 养 法 筛 选 抗 生 素 产 生 菌 程 序
（6）菌落特征
▪ 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物
的一个重要表征。如多糖产生 菌在适当的培养基上生长，从 具有粘液性的菌落外观上就可 以初步识别。
工业上常用的放线菌及产物
链霉菌属 Streptomyces
生产抗生素、维生素、酶及酶抑制剂
诺卡氏菌属 Nocardia
生产抗生素，石油脱蜡、烃类发酵，
处理含氰废水
小单孢菌属 Micromonospora
庆大霉素，Rifamycin
孢囊链霉菌属 Streptosporanium
多霉素
▪ 煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱 除 其 中 的 溶 解 氧 ， 勿 再 摇 动 ， Eh 可 降 至 0.1V 以下
▪ 培养基预还原：将培养基中加入还原性物质： 半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等 降低Eh
（2）创造无氧环境
物理除氧
➢ 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐
抽真空 76mmHg→充入N2 （反复3次）→充入CO2 10% +H2 10% + N2 80%
基本发酵条件:采用300mL三角瓶，装液量50mL，无 菌培养容器封口膜封口，摇瓶转速150rpm，种子液 种龄24h，接种量4%，37℃振荡培养96h。
▪ 初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)
枯草芽孢杆菌合成γ-PGA培养基
优化的回归试验设计
对甘油及柠檬酸添加量的优化(正交组合设计) 选择因素:Z1——甘油（g/L）,40～120; Z2——柠檬酸（g/L）,4～20
放线菌
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常见工业微生物及其产物
酵母 酒精酵母：乙醇 甘油酵母：甘油 假丝酵母：环烷酸、SCP 啤酒酵母：细胞色素、辅酶、酵母片 类酵母：脂肪酶 阿氏假囊酵母：核黄素 脆壁酵母：乳糖酶
常见工业微生物及其产物
霉菌 黑曲霉：柠檬酸、蛋白酶、单宁酶、 糖化酶 栖土曲霉：蛋白酶 根霉：糖化酶、甾体激素、 青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶 木霉：纤维素酶 红曲霉：糖化霉、红曲色素
（3）变色圈法 ▪ 淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 ▪ 支链淀粉平板喷稀碘液： 蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 ▪ 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 ▪ 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶
（4）生长圈法
▪ 工具菌： ➢ 营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的
菌积累的产物
➢ 菌落形态明显不同于目的菌 ▪ 方法：106~107 工具菌与样品稀释液一起涂布至
- 20% 的 菌 株
直 至 最 后 3— 5 株
好氧培养
2.2.5 复筛高产菌株的分类鉴定
菌体形态特征分析 菌体大小、排列、运动性、产芽孢（孢子）特征、 产荚膜？鞭毛、菌丝分枝？染色特征
生理生化特征分析 碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶反应、药物 敏感性
遗传特征鉴定 1、G+C（mol%)（差异>5%可以认为不同种， >10%可以认为不同属, 2、 16s rRNA的基因序列（同源性>97%认为同种）
2.2.2增殖培养（富集培养）
▪ 适用：样品中目的菌数量不够多时 ▪ 目Байду номын сангаас：提高样品中目的菌的数量和比例 ▪ 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以
繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制
1、 方法 （1）控制营养成分
① 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 ②可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 ③酒精废水，可以增殖废水利用菌 * 多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素 （2）控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制
根霉，木霉，青霉 放线菌：单孢菌 其他：藻类
发酵工业常见常用的细菌
Leuconostoc mesenteroides 肠膜明串珠菌
Pediococcus cerevisiae
啤酒足细菌
Bacillus subtilis
枯草芽孢杆菌
Acetobacter aceti
醋化醋杆菌
Lactobacillus delbrukii
① 加1%去氧胆酸钠 ② 察氏培养基：0.01%蔗糖， 0.1%山梨糖
2、平皿反应快速检出法——定性或半定量
（1）纸片培养显色法
▪ 滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 ▪ 用接种环接种 ▪ 保湿恒温培养 ▪ 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量 （2）透明圈法
根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产 物的产量
化学除氧
➢ H2 + O2 → H2O (钯作催化剂） ➢ GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化
学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 ▪ 厌氧指示剂
（3）厌氧分离（培养）技术 ▪ 高层琼脂柱技术 ▪ 厌氧罐技术 ▪ 厌氧手套箱技术
厌氧手套箱
厌氧培养装置
2.2.4 筛选
1、初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行， 每株一瓶
（7）从产物角度出发
▪ 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 ▪ 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 ▪ 产物分子的结构定性分析（利用紫外扫描光谱、
核磁共振、CD谱、高压液相色谱、远红外分析、 X-射线衍射分析、穆斯堡尔谱等） ▪ 产物的定量分析
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3、厌氧性微生物的分离法
（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（氧化 还原电位）
▪ 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改 造可操作性要强
▪ 遗传性能要相对稳定 ▪ 不易感染杂菌或噬菌体 ▪ 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好
与致病菌无关） ▪ 生产特性要符合工艺要求
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2.2 从自然界中分离筛选菌种
生产菌株来源
1、索取或购买 2、自己选育 ▪ 用原有菌株进行遗传改造进行育种
目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌
（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预 先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇 瓶机转数），pH、温度、培养时间等。
（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取 半定量方法
2、复筛：每株3~5瓶，可提前培养种子，使 接种量比较一致，3~5%接种量，