松材线虫、松墨天牛和松树间的共生关系

得分：_______ 南京林业大学研究生课程论文2015 ～20016 学年第二学期课程号：课程名称：论文题目：学科专业：森林保护学号：********名：***任课教师：**二○一六年六月内容本文研究松材线虫、松墨天牛和真菌在松树中的共生关系实验材料和方法：（1）真菌小长喙霉在PDA平板上、25℃条件下培养一周，使用前在5℃条件下保存。

灰葡萄孢在10 mL的大麦籽粒上培养。

（2）线虫强毒虫株松材线虫T-4在25℃条件下在灰葡萄孢上培养，使用前在5℃条件下保存。

松材线虫悬浊液包括成虫和幼虫，悬浊液浓度为50000条/mL。

（3）昆虫松墨天牛在恒定条件下培养（25℃，16h光照、8h黑暗），让其繁殖10代，第七代到第十代成虫用来在赤松小苗上产卵，收集天牛所产的卵并将其放置在湿纸巾上，在一天之内孵化的幼虫用于实验。

（4）松枝2014年六月采伐两颗12年生（胸径分别为3.9和5.2cm）的赤松和两颗12年生的黑松（胸径分别为8.1和9.0cm），分别在实验1和实验3中使用。

2015年二月采伐3颗12年生的赤松用于实验2，胸径分别为7.4、7.6和8.4cm，2014年十月采伐一颗12年生的赤松用于实验4，其胸径为6.8cm。

树枝截为15cm一段，在树枝的两端用石蜡密封起来，每个实验组树枝的树木特定的每组树枝之间不存在显著差异(5)接种使用凿子和镊子在离树端13.7mm处从木质部分离树皮（面积22.3mm×17.3mm），用刻刀在漏出的木质部中间挖一个直径6-7mm圆形刻槽用以放置松墨天牛幼虫，一份带有灰葡萄孢或则没有灰葡萄孢的面积为5×5mm的PDA培养基放置在远离树端、接近圆形刻槽的位置。

用到划长16.8mm、最大宽度为14.3mm的三角形裂口，在漏出的韧皮部接种20uL的线虫悬浊液（1000条线虫）或者是无菌纯净水。

两个树皮伤口最小距离平均为13.7mm，两个伤口接种后覆盖原来的树皮，用封口膜包起来，即使不接种松墨天牛幼虫，也挖一个小刻槽，实验4中松树枝条不用接种松材线虫悬液或水，不会在树皮上形成倾斜伤口。

实验一、为了确定松墨天牛幼虫和小长喙霉对松材线虫种群生长的影响，一组赤松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉。

第二组枝条接种松材线虫、松墨天牛和PDA，第三组枝条接种松材线虫和小喙长霉，第四组枝条接种松材线虫和PDA。

他们被垂直放置使线虫远离容器底部。

25℃，16h光照、8h黑暗，相对湿度100%条件下常温培养，用纯净水保持湿度。

接种18天后，从松枝上剥离树皮，从枝条上取幼虫和幼虫粪便，记录韧皮部和木质部上蓝变面积确定小喙长霉的繁殖情况，从纵向韧皮部上剥离四份之一到二分之一的树皮，将树皮外层剥离，收集里面树皮以获得韧皮部样品，再将里层树皮的韧皮部剪切为1-2mm大小的树皮块，使用一把15mm宽的刀片，从接种松墨天牛幼苗和松材线虫的地方包括髓取木质部样品，记录木质部样品真菌繁殖情况，粪便、韧皮部和木质部分别在25℃下使用贝尔曼漏斗法分离48-72h，计算分离线虫浓度，材料在60℃下烘5-12d，称重，线虫密度表示每克材料干重中松材线虫的数量。

分别使用电子天平和游标卡尺测量幼虫体重和头壳宽度，分别精确到0.1mg和0.05mm，根据头壳宽度确定幼虫龄期：0.585–1.170,1.260–1.935, 1.980–3.150和3.150–4.365 mm分别为一龄、二龄、三龄和四龄虫。

实验二、确定赤松中韧皮部、木质部和天牛幼虫蛀屑线虫密度的不同，在2015年2月26日将刚孵化的幼虫、1000条松材线虫和一份接有小长喙霉的PDA接种在10条直径相似的上述赤松枝条上，2015年3月26日分别将韧皮部、木质部和幼虫蛀屑用以分离线虫，确定线虫密度，实验三、确定松材线虫种群和小喙长霉对松墨天牛生长发育的影响，四组黑松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉三个物种组成的四种组合。

方法和实验一方法相同，培养条件相同。

每天观察松枝，记录松墨天牛羽化情况，分性别记录成虫数量，体重和鞘翅长分别精确到0.1mg和0.05mm。

没有松墨天牛出现的松枝在接种153-164d后分离，称量幼虫的鲜重和记录头宽、颜色、肠内排泄物的有无以及幼虫所在的位置。

实验四、为确定松墨天牛幼虫对小喙长霉繁殖的影响，6个赤松枝条接种小喙长霉和松墨天牛幼虫，接种22d后，剥离松枝树皮，幼虫蛀屑和幼虫取样，测量幼虫体重和头壳宽度文章结构设计思路实验一为研究赤松枝条中松墨天牛幼虫和小喙长霉菌对松材线虫种群的影响，实验选取年龄和粗度相似的赤松为材料，分四组实验进行，一组赤松实验材料只接种松材线虫、一组赤松材料接种松材线虫和松墨天牛，一组赤松材料接种松材线虫和小喙长霉菌，最后一组赤松实验材料接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉菌，四组实验之间彼此形成对照，通过测量不同接种组合、不同部位的松材线虫密度和松墨天牛的体重和头宽指标来确定三者之间的相互影响。

实验二为研究韧皮部、木质部和天牛幼虫粪便中线虫密度的不同，刚孵化的松墨天牛、松材线虫和小喙长霉菌接种在10个粗细相似的赤松枝条上，按照实验一发法在各部位取样，测定松材线虫密度。

实验三为研究松材线虫种群和小喙长霉菌对松墨天牛生长发育的影响，在四组黑松实验材料上按照实验一中接种方法接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉菌三个物种的组合。

每天观察记录松墨天牛成虫出现情况，测定体重和鞘翅长度指标。

在接种后153-164天后，解剖没有松墨天牛出现的松树枝条，称量记录活天牛幼虫的头宽、身体颜色、排泄物状态和其在松树枝条内所在的位置。

实验四研究松墨天牛对小喙长霉菌影响，6个赤松枝条接种松墨天牛和小灰长霉菌，24天后，在接种位置上剥离树皮，从松树枝条上取下幼虫和幼虫粪便，取整个松树枝条四分之一到二分之一的树皮（包括天牛取食过的树皮，不包括石蜡覆盖的树皮）去除外层树皮，韧皮部切成1-2cm宽的小块，使用手钻在接种松墨天牛和小喙长霉菌的位置取韧皮部包括髓，松墨天牛粪便、韧皮部和木质部放在聚乙烯袋子里，-20℃下保存，两天后，在真空状态下冻干。

测定麦角固醇含量。

结果和结论实验一在接种18天后，解剖松树枝条，在树皮下发现20只活的天牛幼虫和4只死的天牛幼虫，活天牛幼虫包括1个一龄幼虫、2个二龄幼虫和17个三龄幼虫，平均体重99.2mg，平均头壳宽2.23mm，在幼虫肠道内发现粪便。

解剖实验表明在单独接种松材线虫的11个松树枝条中有6个松树枝条可观察到小喙长霉菌，在接种松材线虫和人松墨天牛的12个松树枝条中有9个松树枝条可观察到小灰长霉菌，在单独接种小灰长霉菌的所有松树枝条上的木质部和韧皮部均有真菌分布。

在未接种松墨天牛幼虫的松树枝条，木质部和韧皮部的分别分离到线虫量为2.2g和2.9g，在接种松墨天牛幼虫的松树枝条上，木质部、韧皮部和粪便中分别分离到3.6g、3.2g和0.29g松材线虫。

平均线虫密度随接种位置、松墨天牛幼虫及真菌的有无而不同，在未接种真菌的松树枝条木质部的松材线虫密度小于其他接种位置的松材线虫密度，小于接种真菌的松树枝条。

未接种松墨天牛幼虫的松树枝条线虫密度大于接种松墨天牛幼虫的松树枝条线虫密度。

双因素方差分析表明，在接种松墨天牛幼虫的受接种位置和真菌有无影响，但不受接种位置和真菌互作影响，松材线虫密度在粪便中最大，其次为木质部，最小为韧皮部。

实验二在接种刚孵化的松墨天牛幼虫的赤松枝条中存在天牛粪便，解剖发现9个活的天牛和1个死亡的天牛幼虫，活天牛幼虫平均体重为118.4mg，头壳宽2.19mm，表明活天牛为三龄幼虫，死亡天牛头壳宽为1.35mm，说明此为二龄幼虫，解剖实验发现在10个松树枝条的韧皮部存和5个松树枝条的部分木质部存在真菌。

韧皮部、木质部和粪便线虫密度为5.3g、3.3g和0.52g。

双因素方差分析表明，线虫密度受接种位置影响，但不受松树枝条影响，松材线虫密度最大为天牛粪便、其次为韧皮部和木质部。

实验三在接种幼虫后的71天到167天期间出现23只雌天牛和30只雄天牛，在接种后153-164天后解剖松树枝条发现在木质部蛹室内发现11只活天牛幼虫和9只死亡天牛幼虫，活天牛幼虫平均体重为982.3mg，头壳宽为3.89mm，体色为黄白色到黄色，表明他们是四龄幼虫。

方差分析表明成虫的体重不受真菌接种实验、线虫接种、性别、树皮面积和彼此之间互作关系影响。

方差分析也表明天牛鞘翅长度受真菌和松材线虫互作关系、真菌、松材线虫和树皮面积三者互作关系的影响，但是不受真菌、线虫和树皮面积的影响。

雌天牛的鞘翅比雄天牛鞘翅长。

鞘翅长度与树皮面积呈负相关关系。

方差分析显示接种天牛幼虫后，天牛成虫出现时间不受真菌、线虫、树皮面积和天牛性别以及彼此之间互作关系的影响。

实验四在接种22天后，在松树枝条发现6只活天牛幼虫，平均体重171.2mg，平均头壳宽为2.4mm，表明他们为三龄幼虫。

天牛粪便的麦角固醇含量最大，其次为韧皮部和木质部，方差分析显示三者之间存在极显著差异。

创新性指导意义实验过程控制单因素变量，实验测定的指标多样，可以从不同角度反映实验结果，实验分析多样化，实验数据多次筛选，层层分析，增加数据可靠性。

不足之处实验中只考虑线虫取食小喙长霉菌，没有考虑线虫取食松树枝条活细胞的实验四研究松墨天牛对小喙长霉菌影响，实验中在6个赤松枝条上均接种松墨天牛幼虫和小喙长霉菌，但未在赤松枝条上单独接种小喙长霉菌作为对照。

ReferencesAkbulut S, Linit MJ (1999) Flight performance of Monochamus carolinensis (Coleoptera: Cerambycidae) with respect to nematode phoresis and beetle characteristics. EnvironEntomol 28:1014–1020.Arakawa Y, Togashi K (2002) Newly discovered transmission pathway of Bursaphelenchus xylophilus from males of the beetle Monochamus alternatus to Pinus densiflora trees via oviposition wounds. J Nematol 34:396–404Carlile MJ, Watkinson SC, Gooday GW (2001) The fungi, 2nd edn. Academic Press, New York Dowding P (1970) Colonization of freshly bared pine sapwood surfaces by staining fungi. Trans Br Mycol Soc 55:399–412Edwards OR, Linit MJ (1992) Transmission of Bursaphelenchus xylophilus through oviposition wounds of Monochamus carolinensis (Coleoptera: Cerambycidae). J Nematol 24:133–139 Haack RA, Slansky F (1987) Nutritionalecology of wood-feeding Coleoptera, Lepidoptera, and Hymenoptera. In: Slansky F, Rodriguez JG (eds) Nutritional ecology of insects, mites,spiders, and related invertebrates. Wiley, New York, pp 449–486Ichihara Y, Fukuda K, Suzuki K (2000) Early symptom development and histological changes associated with migration of Bursaphelenchus xylophilus in seedling tissues of Pinusthunbergii. Plant Dis 84:675–680Kanzaki N, Futai K (2001) Life history of Bursaphelenchus conicaudatus (Nematoda: Apehelenchoididae) in relation to the yellowspotted longicorn beetle, Psachothea hilaris(Coleoptera: Cerambycidae). Nematology 3:473–479Kanzaki N, Futai K (2002) Life history of Rhabdontolaimus psacotheae (Diplogasterida: Diplogasteroididae) and its habitat segregation from Bursaphelenchus conicaudatus(Aphelenchida: Aphelenchoididae). Jpn J Nematol 32:60–68Kaya HK (1984) Nematode parasites of bark beetles. In: Nickle WR (ed) Plant and insect nematodes. Marcel Dekker, New York, pp 727–754Kobayashi T, Sasaki K, Mamiya Y (1974) Fungi associated with Bursaphelenchus lignicolus, the pine wood nematode (I). J Jpn Soc 56:136–145 (in Japanese with English summary) Kojima K, Katagiri K (1964) On the larval instar and changes of its composition of Monochamus alternatus Hope. J Jpn Soc 46:307–310 (in Japanese with English summary)Kuroda K, Ito S (1992) Migration speed of pine wood nematodes and activities of other microbes during the development of pine-wilt disease in Pinus thunbergii. J Jpn Soc 74:383–389 (in Japanese with English summary)Maehara N, Futai K (2000) Population changes of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae), on fungi growing in pine-branch segments. ApplEntomol Zool 35:413–417Mamiya Y (1983) Pathology of the pine wilt disease caused by Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol 21:201–220Mamiya Y, Enda N (1972) Transmission of Bursaphelenchus lignicolus (Nematoda: Aphelenchoididae) by Monochamus alternatus (Coleoptera: Cerambycidae). Nematologica 18:159–162Massey CL (1974) Biology and taxonomy of nematode parasites and associates of bark beetles in the United States, Agricultural Handbook 446. USDA Forestry Service, Washington Matsunaga K, Togashi K (2009) Seasonal change in susceptibility of Pinus densiflora to Bursaphelenchus xylophilus infection, determined from the number of nematodes passing through branch sections. Nematology 11:409–418Ochi K (1975) Ecological studies on the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus Hope (Coleoptera: Cerambycidae). II. Size of the first instar larva. In: Transactions of the 86thannual meeting of the Japanese Forestry Society. pp 323–324 (in Japanese)Oku H, Shiraishi T, Chikamatsu K (1989) Active defense as a mechanism of resistance in pine against pine wilt disease. Ann Phytopathol Soc Jpn 55:603–608Rutherford TA, Webster JM (1987) Distribution of pine wilt disease with respect to temperature in North America, Japan, and Europe. Can J Res 17:1050–1059Rühm W (1956) Die Nematoden der Ipiden. Parasitologische Schriftenreihe 6:1–435Seitz LM, Mohr HE, Burroughs R, Sauer DB (1977) Ergosterol as an indicator of fungal invasion in grains. Cereals Chem 54:1207–1217Son JA, Komatsu M, Matsushita N, Hogetsu T (2010) Migration of pine wood nematodes in the tissues of Pinus thunbergii. J Res 15:186–193Sudhaus W, von Lieven AF (2003) A phylogenetic classification and catalogue of the Diplogastridae (Secernentea, Nematoda). J Nematode Morphol System 6:43–89Togashi K (1991) Different developments of overwintered larvae of Monochamus alternatus (Coleoptera: Cerambycidae) under a constant temperature. Jpn J Entomol 59:149–154 Togashi K (1997) Lifetime fecundity and body size of Monochamus alternatus (Coleoptera: Cerambycidae) at a constant temperature. Jpn J Entomol 65:458–470Togashi K (2014) Effects of larval food shortage on diapause induction and adult traits in Taiwanese Monochamus alternatus alternatus. Entomol Exp Appl 151:34–42Togashi K, Matsunaga K (2003) Between-isolate difference in dispersal ability of Bursaphelenchus xylophilus and the vulnerability to inhibition by Pinus densiflora.Nematology 5:559–564Togashi K, Sekizuka H (1982) Influence of the pine wood nematode, Bursaphelenchus lignicolus (Nematoda: Aphelenchoididae), on longevity of its vector, Monochamus alternatus(Coleoptera: Cerambycidae). Appl Entomol Zool 17:160–165Wingfield MJ, Blanchette RA (1983) The pine-wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus in Minnesota and Wisconsin: insect associates and transmission studies. Can J Res 13:1068–1076Wingfield MJ, Blanchette RA, Nicholls TH (1984) Is the pine wood nematode an important pathogen in the United States? J Forestry 82:232–235Zhao LL, Lu M, Niu HT, Fang GF, Zhang SA, Sun JH (2013) A native fungal symbiont facilitates the prevalence and development of an invasive pathogen-native vector symbiosis. Ecology 94:2817–2826Zhao LL, Mota M, Vieira P, Butcher RA, Sun JH (2014) Interspecific communication between pinewood nematode, its insect vector, and associated microbes. Trends Parasitol 30:299–308。