生物大分子的分离与纯化

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注意事项
1.过氧化氢酶的最适温度与热稳定性 鸭肝过氧化氢酶的最适温度为40 ℃左右，20～40 ℃具
有较好的热稳定性, 保温60 min 活性保留原有活性的90 % 以上. 该酶60 ℃保温60 min 活性丧失50 %以上, 65 ℃保温10 min 活性损失殆尽。 2. 过氧化氢酶的最适pH与pH稳定性
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实验原理
1.离子交换层析原理:固定相为离子交换剂， 是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲 和力，来分离混合物中各种离子的层析技 术。
2.凝胶过滤层析原理:也称分子筛层析、排阻 层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子 筛作用，根据被分离物质的分子大小不同 来进行分离。
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3.电泳法的基本原理:电泳（electrophoresis）是指 带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带 电荷相反的电极移动的现象。物质分子在正常情 况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不 显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应 条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒 子）。不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状 和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方 向和移动速度也不同，因此可使它们分离。
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3）透析法纯化过氧化氢酶:将沉淀重溶于
0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH=7.2) 中, 4 ℃ 透析过夜,然后按1∶1的比例向透析液中加 入预冷的正丁醇进行脱脂,4℃静置过夜.然 后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇层, 重复2次,得粗酶液.
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2.DEAE2Sep haro se 离子交换层析： 用磷酸缓冲液(0.05 mol/ L , p H =7.2) 平衡 至少4 倍柱体积(20 mL) , 上样5 mL . 用0～1 mol/ LNaCl溶液(含0.05 mol/ L , p H =7.2 的 磷酸缓冲液) 进行梯度洗脱, 流速30 mL/ h , 每管收集5 mL , 紫外监测波长为280 nm ; 测 定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量; 收集活 性较高的各管酶液, 4 ℃透析过夜, 冷冻干燥 后进行凝胶过滤.
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实验步骤
1.粗酶液的制备：1）称取新鲜鸭肝100 g , 用自来水 洗净, 再用消毒双蒸水漂洗干净. 按1:5 的比例加入 预冷的0.05 mol/ L 的磷酸缓冲液(p H 7.2) , 用高速 组织捣碎机捣碎, 置于4 ℃冰箱抽提2 h ; 离心(6 000 r/ min ,4 ℃, 30 min) , 收集上清液。 2）盐析法粗提过氧化氢酶:加入硫酸铵至40 %饱和 度, 离心(6 000 r/ min , 4 ℃, 30 min) 去沉淀, 上清中 再加硫酸铵至60 %饱和度, 离心收集沉淀。
生物大分子的分离、 纯化与鉴定
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实验目的
1. 学习科学课题研究的基本程序。 2. 培养创新意识、独立思考、分析和综 合问题的能力。启发学生查阅文献， 自己设计试验方案和步骤 3.正确设计从生物样品中分离纯化生物 大分子的技术路线和正确实施设计方 案
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过氧化氢酶
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过氧化氢酶
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3. Sep hacryl S2200 凝胶过滤柱层析 Sephacryl S2200 凝胶柱按产品说明书要求处 理, 装柱(16 mm ×835 mm) 后, 用磷酸缓冲液 (0.05 mol/ L ,pH=7.2) 冲洗一定体积, 上样2 mL . 用磷酸缓冲液(0.05 mol/ L , pH7.2) 进行 洗脱, 流速18 mL/ h , 每管收集3 mL ; 测定每 管过氧化氢酶活性和蛋白含量; 收集活性较 高的各管酶液, 4 ℃透析、冷冻干燥, 得到过 氧化氢酶纯品.
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实验材料与试剂
1.家鸭肝脏取自健康活鸭 2.试剂： 0.05 mol/ L 的磷酸缓冲液(pH=7.2)，硫酸
铵，0～1 mol/ LNaCl，正丁醇
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实验仪器
1.电泳仪、垂直板电泳槽。 2.微量加样器 3.烧杯、吸量管、滴管、微量加样器 4.离心机、蠕动泵 5.玻璃层析柱、螺旋夹、铁架台、试管
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鸭肝过氧化氢酶在p H 710 左右时活性最强, p H 510～ 715 活力较高, 超出其范围活力较低。
鸭肝过氧化氢酶在p H 3～8 的范围内是比较稳定的, 在 p H5～8 的范围内活性基本保留原有活性的90 %以上, p H 910 时, 残余酶活力不到60 %
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谢谢！
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过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于需 氧动植物及微生物细胞中的氧化还原酶,结构上由 4个具有相同多肽链的亚基组成,生物学功能是催 化细胞内H2O2 分解,防止过多H2O2对细胞的危害。 现今过氧化氢酶已广泛应用于农业、纺织业、食 品与乳制品业、纸浆和造纸业以及农业环保产业 中,其制备的研究越来越受到人们的重视 。目前已 有从牛肝 ,猪肝 ,动物血液 、贻贝以及人胎盘等中 分离纯化过氧化氢酶方法的报道,但不同程度上存 在制备效率不理想、成本昂贵、技术要求高等问 题。
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4.电泳分析
分离纯化过程中,采用12%分离胶的SDS PAGE分离蛋白,用考马斯亮兰R - 250 显色, 观察各阶段产物的纯度变化,分析纯化效果, 并鉴定纯化产物的大小。
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实验结果预期
Sep hacryl S2200 凝胶层析测得鸭肝过氧 化的全分子量为250 KD , SDS2PA GE 法测 其多肽链分子量为6215 KD , 表明鸭肝过氧 化氢酶由4 条相同的多肽链组成.