5多糖分子量测定

第六章 多糖的分子量测定
样品 (4)分子量计算: R—气体常数(848) 浓度C (g/100 mL) T—绝对温度 渗压" π—渗透压 π/C D—密度 1
O.209
2
0.403
3
0.626 0.8 1.238
O.3 0.5 1.435 4 1.271 7
wk.baidu.com
将π/C对C作图求得 π/C c→0为1.50.T=24℃ ,D=0.9973代人式得: M≈168 00. 168O M≈168O00
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
[操作] 操作] (1) 精确称取样品100～200 mg,放在500 mL具磨砂口的圆 底烧瓶中,加蒸馏水3 mL,使样品吸水润湿,再加浓度为O.4 mol/L的醋酸5 mL和浓度为O.8 mol/L的KCN的溶液5 mL,盖 上玻璃塞后于39℃温度保温48小时.然后用酸将反应液酸化至 甲基红呈酸性. (2)通以空气,驱逐反应液中剩留的氰化物,然后加浓度为 20%的氢氧化钠溶液10mL. (3)以蒸汽蒸馏法将氨蒸出并吸收于一定体积(VHCL,)的标准 盐酸中.蒸馏完毕,以标准氢氧化钠滴定盐酸(吸收溶液),记 录所消耗的氢氧化钠的体积(VNAOH). (4)样品的分子量: M=样品质量/[( HCL*0 01) NAOH*0 01) M=样品质量/[(VHCL*0.01)-(VNAOH*0.01) 样品质量
第六章 多糖的分子量测定
把多糖转化为氰醇(cynohydrin)的测定法: 把多糖转化为氰醇(cynohydrin)的测定法: (cynohydrin)的测定法 把多糖(P)与氰化钾反应,成为多糖氰醇(PCHOHCN),然后在 碱性条件下使氰醇水解,释放出氨 PCHO——>PCHOHCN PCHO >PCHOHCN——>NH3 > 释放的氨用标准浓度盐酸吸收,再用氢氧化钠滴定.释放 的氨的毫摩尔量,即为多糖还原基团的毫摩尔量,从而计算多 糖的分子量. 本方法常用于纤维素等的分子量测定. 试剂] [试剂] O.4 mol/L醋酸, O.8 mol/L氰化钾溶液, 20%氢氧化钠溶液, O.01 mol/L的标准盐酸, O.01 mol/L的标准氢氧化钠.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
由于不同分子量大小的多糖具有不同的性 质,在多糖的应用中,如以其作为试剂使用 于某些实验时,往往需要在它的分子量大小 方面作选择.可见,不论在多糖性质的研究, 或是在它的用途等方面,都涉及分子量方面 的问题,往往需要测定它的分子量.因而测 定分子量成为研究和制备多糖的一项经常性 工作.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
[操作] 操作] (1)精确称取样品1～2 g,用蒸馏水溶解后,配制成50 mL,吸取两 份5 mL分别置于两只容量为100 mL具磨砂口的三角烧瓶. (2)另取一只100 mL具磨砂口的三角烧瓶,盛放5 mL蒸馏水,作滴定 对照用. (3)向三角烧瓶中分别加入碱性铜盐试剂5 mL,然后接上具磨砂接头 的冷凝管,放入正在沸腾的水浴中,煮沸30分钟之后,小心地把它们 从水浴取出,取时勿使瓶中溶液搅动,待冷至室温后,于各瓶中精确 量加O.01 mol/L的碘酸钾溶液15 mL,再加2.5%的碘化钾溶液1 mL(须沿瓶壁加入,使沾在瓶壁上的反应液淋洗入瓶中,加液时勿使 反应液搅动,避免受空气氧化),再加1 mol/L的H2S04 1.5 mL,加 毕后立即搅拌混匀,然后加1%可溶性淀粉l mL为指示剂,用O.002 5mol/l的硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色退去为止.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
五,分子筛法
[原理] 原理] 凝胶过滤测定中,洗脱体积称为Ve,当分子量足够大, 过凝胶柱时不进入凝胶的洗脱体积为死体积V0,小分子物 质进入柱子后,其洗脱体积较大,极限值为Vt,即床体积.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
Kav为分配系数,表示物质在流动相(凝胶珠外的液体)和固 定相(包括凝胶内的液体和凝胶本身)之间的分配比,则有: Kav=(Ve-Vo)/(VtKav=(Ve-Vo)/(Vt-V0), 另一种分配因子的表示法为Kd,即溶质在凝胶外液体和凝胶 内液体体积Vi之间的分配比 Kd=(Ve- )/Vi, Kd=(Ve-V0)/Vi Kav可能与球状蛋白或多糖的表观Stokes半径rs有关,并有下 式 Kav=exp[Kav=exp[-丌L(rs+rr)(rs+rr)] 式中,L表示固定相浓度,rr表示固定相棒状分子的半径,对 于类似形状和水合作用的分子,rs与分子量之间存在一种固定的 相互关系. Kav,Kd及其他凝胶过滤参数与球状蛋白和糖胺聚糖分子量之 间的经验关系式已经建立.对于球状蛋白,Kav对lgM作图得校正 曲线.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
因
n=W/M, W=CV, 代人上式简化后得: M=RT/(π/C ) (1—2) 2 C:浓度 有些研究者认为应当考虑溶剂在不同温度时的密度D,即 M=RT/(π/c*D) (1—3) 3 D:密度 仪器和试剂] [仪器和试剂] 本试验采用的膜渗透压计为德国Knauer公司的膜渗透仪. 与该公司特制的专为测定水溶性物质用的双层膜作为半透膜, 溶剂为脱气蒸馏水. 膜渗透仪的主要部件是渗透池,由半透膜分隔成上下两池, 下池底部中央有一压敏换能元件.操作时先将下池充满纯水, 加上半膜后再将上池充满测定的溶液.在恒温条件下使两池达 成平衡,压力之差由换能器输出信号放大后记录,求得π值.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
渗透压法: 一,渗透压法: 利用膜渗透压计(Membrane Osmometer,简称MO仪) 可以测定范围在1万～50万之间的多糖分子量.本法 不需用标准品. 原理] [原理]:把多糖水溶液装在半透膜制成的透析袋内, 袋外为溶剂(水),水分子可以自由通过半透膜,多糖 分子则不能通过透析膜,因此袋内的多糖分子必将吸 引更多的水分子渗入袋内,形成一定的渗透压.渗透 压与溶液中的溶质分子数有关,可以用范特荷甫公式 表示,即 πV=nRT (1-1) 式中π——渗透压; V——溶液体积; n——溶液摩尔数; R——气体常数; T——绝对温度.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
(2)用同样方法,取试剂15 mL放人试管,经保温,待冷却到 室温后,移人容量瓶加水到50 mL,作为对照溶液.比色时用 500nm滤光板. (3)如果检测的样品是淀粉,则可用麦芽糖作参比物.取麦芽 (3) 糖4mg,与检样的显色反应同样操作. (4)从50 mL容量瓶中取一部分作适当稀释,配制成几个不同 浓度的溶液,测定它们的光密度,作浓度光密度曲线图. 图中的麦芽糖浓度,可以用麦芽糖的毫摩尔表示,读取样 品的光密度之后,从该曲线查对其相应的毫摩尔数,从而计算 样品的分子量:
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
膜渗透压计示意图
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
[操作] 操作] 以右旋糖酐分子量的测定为例. (1)仪器准备:将脱气后的蒸馏水充满下池.浸泡好的半透膜 覆盖其上并注意勿使气泡进入.将上池压紧.按操作要求逐步 旋紧中心螺丝(约8小时),装上针阀及校正杯进行仪器校正(约 12小时),取下针形阀及校正杯,装上进样管,用溶剂充分冲洗 后,开动记录仪,划出基线(约12小时). (2)样品准备:每一测定的样品需配3～5个不同浓度的溶液. 本试验中用右旋糖酐配制成 O.209 g/100 mL(C1),O.403 g/ 100 mL(C2)及O.626 g/lOO mL(C3)3种浓度的溶液. (3)样品测定:先用浓度为C1的样品由进样管注入上池,清洗 3次,再注满进行测量,直到记录仪达到平衡.划出的直线与基 线之间的距离即为该浓度溶液的π值. 同法测定C2,C3溶液的π值.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
如果检测的样品是右旋糖酐,参比物应以异麦芽糖为宜,但是异麦 芽糖的结晶纯化比较困难,可改用龙胆二糖(gentiobiose)作参 比物.龙胆二糖是β结构1—6的葡萄糖双糖,实验证明,异麦芽 糖的还原性质为龙胆二糖的93.9%,因此用龙胆二糖作参比物 去计算右旋糖酐的分子量需要经过校准. 用硫代硫酸钠溶液滴定测定龙胆二糖,每毫升O.002 5mol/L 的硫代硫酸钠相当于0.216 mg龙胆二糖,因此样品(右旋糖酐) 的分子量: M=0 939W/V( 216/342. W/V(0 M=0.939W/V(0.216/342.3) 式中W-----样品的取量(mg); V----滴定时用去的O.002 5%mol/L的硫代硫酸钠体积 (mL)(空白对照滴定值减去样品滴定值).
M=样品(mg)/x. M=样品(mg)/x. 样品(mg)/x
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
碱性铜盐试剂反应滴定法: 以碱性铜盐试剂氧化还原糖方法,测定多糖端基的半缩醛基团 ,从而计算出它的分子量. [试剂] 试剂] 碱性铜盐试剂:Na2HPO412H2O 76.6 g, 酒石酸钾钠40 g, 浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液100 mL, 浓度为10%的CuSO45H2O的溶液80 mL,Na2S04 180 g,加水配 成1000 mL. O.01 mol/L碘酸钾溶液 2.5%碘化钾溶液(用时新鲜配制) l mol/L H2S04 0.0025 mol/L硫代硫酸钠溶液(临用前,以O.02 mol几的 硫代硫酸钠溶液稀释,经标定后使用).
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
下面介绍几种常用的测定多糖还原端基的定量分析方法: 3,5一二硝基水杨酸比色法 本方法在还原糖与3,5一二硝基水杨酸反应时,产生颜色. 测定检样时,用一个已知分子量和已知浓度的溶液作参比,经 过比色,计算检样的分子量. [试剂] 试剂] 3,5一二硝基水杨酸溶液:称取666 mg经2次重结晶的3,5 一二硝基水杨酸,溶解于200 mL浓度为1 mol/L的氢氧化钾溶 液中. [操作] 操作] (1)称取样品100～200 mg放人100 mm×20 mm试管,加15 mL试 剂,经过搅拌使样品溶解,然后在65℃的恒温水浴中保温1小时 ,待冷却至室温后,将反应液移入50 mL容量瓶,用水淋洗反应 管多次,淋洗液并入容量瓶,添加水至刻度.
第5章 章
多糖的分子量测定
多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项 较为重要的工作.多糖的性质往往与它的分 子量大小有关.例如,多糖溶液的粘度不但 随浓度的增大而升高,而且与多糖分子量大 小有关.一般说来,分子量增大,粘度增高. 在生物学研究中,发现某些多糖由于分 子量大小方面的差别,所产生的某些效应也 有一定差异.
RT M= π × D CC-O
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
二,端基法 原理] [ 原理] 测定单位重量样品中所含可测端基之数,计算检样的分子 量. 例如,对某一种多糖的分子结构,业已明确知道它每一个分 子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为A mmol, 那么,该多糖的分子量应该是1/A. 可见检样的分子量,是它每毫克重量中所含可测端基的毫摩 尔数的倒数,在端基法测定分子量时,分子量计算的通式为: 检样重量mg 可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn) mg/ (mmol)=检样的分子量 检样重量mg/可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn) 用端基法测分子量要求检样的化学结构须具备如下两个条件: (1)每一个分子链端须具有可以用化学方法作分析的基团, 以便采用一定的定量分析方法,对该端基作定量分析. (2)检样的每一个分子链,它所含可测端基的数目,不但须 明确,而且数目应固定不变.
第4章 章
多糖的干燥和纯度鉴定
测定多糖分子量时,为了避免因存在杂质而影 响测定结果,需要把检测的样品(简称样品或 检样)适当提纯.用于分子量测定的样品,纯 度要求虽然不十分高,但至少要达到 : (1)去除杂质和水分. (2)把不同化学结构的组分相互分开,使它们在 测定分子量中不相互干扰. (3)把不同分子量大小的组分相互分开. 另外,在用某些方法进行分子量测定时,需要先 将小分子量的盐和单糖除去.