蛋白质各种定量方法的优缺点的比较

蛋白质各种定量方法得优缺点得比较

１。蛋白质得常规检测方法

1.１凯氏(Kｊeldaｈl)定氮法

一种最经典得蛋白质检测方法。

原理:样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量得硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。

优点:范围广泛、测定结果准确、重现性好

缺点:操作复杂费时、试剂消耗量大

1。2 双缩脲法

常用于需要快速但并不需要十分精确得蛋白质检测。

原理:双缩脲(NＨ３ＣＯNHCＯNH3)就是３分子得脲经180℃左右加热,放出1分子氨后得到得产物。在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物(肽键中得氮原子与铜离子配价结合),称为双缩脲反应。紫色络合物颜色得深浅与蛋白质浓度成正比,因此可用来测定蛋白质含量。

测定范围:１～１0mg(有得文献记载为1～2０mg)

优点:较快速,干扰物质少,不同蛋白质产生得颜色深浅相近

缺点:①灵敏度差;

②三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸与ＥDTA等会干扰该反应。

1、3 Foliｎ—酚试剂法

原理:Folin—酚法得原理与双缩脲法大体相同,利用蛋白质中得肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于Fｏlin—酚试剂中得磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中得酪氨酸与苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色得钼蓝与钨蓝得混合物。在一定得条件下,蓝色深度与蛋白得量成正比,由此可测定蛋白质得含量。

测定范围:２0～２50uｇ

优点:灵敏度高,对水溶性蛋白质含量得测定很有效

缺点:①费时,要精确控制操作时间;

②Ｆolin－酚法试剂得配制比较繁琐,且酚类与柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘

氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA与脲素均会干扰反应。

1.4 紫外吸收法

原理:蛋白质分子中得酪氨酸、苯丙氨酸与色氨酸残基使其在280ｎｍ处具有紫外吸收,其吸光度与蛋白质含量成正比)。此外,蛋白质溶液在28０nｍ得吸光度值与肽键含量成正比,利用一定波长下蛋白质溶液得吸光度值与蛋白质浓度得正比关系可以测定蛋白质含量、

优点:简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后能回收。

缺点:①测定蛋白质含量得准确度较差,专一性差;

②干扰物质多,若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光得物质,会出现较大得

干扰。

定氮法、双缩脲法、Fｉlon-酚试剂法与紫外吸收法为常用得４种古老得经典方法。

1.5考马斯亮蓝法

原理:染料考马斯亮蓝Ｇ－25０在酸性溶液中与蛋白质中得碱性氨基酸(特别就是精氨酸)及芳香族氨基酸残基相结合,使染料最大吸收峰得位置由46５nm 变为595ｎm,溶液得颜色也由棕黑色变为蓝色,在５９5nm下测定得吸光度值与蛋白质浓度呈正比、

优点:灵敏度高,测定快速、简便,干扰物质少,不受酚类、游离氨基酸与缓冲剂、络合剂得影响,适合大量样品得测定。

缺点:由于各种蛋白质中得精氨酸与芳香族氨基酸得含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大得偏差。

２. 蛋白质得电化学检测方法

2、1蛋白芯片技术

原理:将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测得芯片,然后用标记特定荧光物质得抗体与芯片上得蛋白质相匹配结合,抗体上得荧光将指示对应得蛋白质及其表达数量。

优点:快速、低成本

2.2 电化学免疫传感器

原理:电化学免疫传感器就是基于抗原抗体反应,可进行特异性得定量分析得自给式得集成器件, 抗原、抗体就是分子识别元件,且与电化学传感元件直接接触,并通过传感元件把某种化学物质浓度信号转变为相应得电信号。

３、蛋白质得分子生物学检测方法

3、1邻位连接技术

原理:首先将不同得DＮA 单链分别与蛋白质识别分子相结合,形成PLＡ探针,经过类似酶联免疫吸附法(EＬＩSA)中得温育过程,2条含有不同DNA 序列得PLA探针会同时结合到同一个待测蛋白质分子上。此时,2 条探针得ＤNA尾部便在空间上紧密靠近、在过量得互补连接序列与NDA连接酶得作用下,2 条探针ＤNA尾部得游离５’端与3’端与互补序列杂交并发生连接反应,形成一个环状得蛋白质—蛋白识别分子-单链DN Ａ复合物、该复合物量得多少,完全取决于样品中待测蛋白质分子得量,故可用于蛋白质得定量分析。

优点:检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设常见

3.2 核酸适体

原理:直接在核酸适体上共价修饰荧光基团,利用它与靶分子结合时荧光信号得变化实现对靶分子得检测。修饰有荧光熄灭基团得核酸适体探针通过静电作用与阳离子荧光共轭聚合物结合,导致后者荧光熄灭,当加入靶蛋白后,核酸适体探针与其特异性结合,荧光熄灭基团与阳离子荧光共轭聚合物远离,聚合物荧光信号得以恢复。

优点:检测限低,检测线性范围广

3、3 电泳法

原理:电泳法,就就是指带电荷得供试品(如蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如滤纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,在电场得作用下,向其对应得电极方向按各自得速度进行泳动,由于各组分之间得移动速度不同,使各组分分离成狭窄得区带,并用适宜得检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量。

优点:操作简便、快速、样品用量少、高自动化。

缺点:存在核酸、多糖、脂类等干扰分子,影响检测结果。

3。4 二甲酸喹啉(BCA)法

原理:在碱性溶液中,蛋白质将Ｃu2。＋还原成Cｕ+,BCＡ与Cu、。＋结合形成稳定得蓝紫色复合物,在562nｍ处具有最大吸收峰,在一定条件下,此复合物得吸光度与蛋白质浓度成正比。

优点:试剂单一,终产物稳定,除对还原性糖类得干扰敏感外,对其她物质包括常用蛋白质增溶得表面活性物质如ＳDS等均无影响、

缺点:反应时间长且蛋白质也会发生不可逆得变性。

4、免疫法