液相色谱／质谱联用技术

液相色谱／质谱联用技术李立军

色谱是快速灵敏分离有机物的有效手段，各种检测器中，除了应用最广泛的 FID（GC）和UV（LC）外，质谱（MS）尽管价格较昂贵，但是其选择性、灵敏度、分子量及结构信息等优势，已被公认为高级的通用型检测器，把它与各种分离手段联用，将定性、定量结果有机地结合在一起，一直是人们所研究的目标。

GC／MS在我国已有 20多年的应用历史，随着台式小型仪器迅速增长，在色谱研究中已经成为重要的手段，气相色谱质谱技术成熟运用至今，人们越来越不满足仅仅分析那些具有挥发性和低分子量的化合物，面对日益增加的大分子量（特别是蛋白，多肽等）和不挥发化合物的分析任务，迫切需要用液相色谱／质谱联用解决实际间题。与气相色谱相比，液相色谱的分离能力有着不可比拟的优势，液相色谱／质谱联用技术为人们认识和改造自然提供了强有力的工具。HPLC可以直接分离难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，LC ／MS联机曾长期为分析界所期待，由于LC流动相与MS传统电离源的高真空难以相容，还要在温和的条件下使样品带上电荷而样品本身不分解，大量的样品不得不采取脱机方式 MS 鉴定，或制成衍生物用 GC／MS分析。经过努力相继出现了多种液相色谱／质谱联用接口，实现了液相色谱／质谱的联用。特别是大气压电离质谱（APIMS）的实现为 LC／MS的兼容创造了机会，商品化的小型 LC／MS作为成熟的常规分析仪器在九十年代已经在生物医药实验室发挥着重要的作用。

一．液相色谱／质谱联用适用范围

液相色谱／质谱联用的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一组分，依次通过液相色谱／质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。

图1 液相色谱／质谱联用的基本流程

首先看看气相色谱／质谱联用的特点：

·要求样品气化后进入质谱仪

·用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比

·用毛细管色谱柱分离化合物，分高效率高

·操作条件稳定、使用方法成熟

·适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物

液相色谱／质谱联用主要可解决如下几方面的问题：

①不挥发性化合物分析测定；

②极性化合物的分析测定；

③热不稳定化合物的分析测定；

④大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等）的分析测定；

附图清楚地表明了各种接口技术的适用范围。

二．液相色谱／质谱接口的发展

起步于70年代，先后研究出27种接口

1．传送带（MB）LC／MS接口方式

七十年代末采用传送带方式与MS传统的EI，CI离子源相联。灵敏度差，不能用反相柱，待测样品必须汽化后再电离。中国至少买了8台，现已淘汰。

2．热喷雾（TS）

产生于八十年代中期，不仅是LC／MS接口，也是软电离方式，热喷雾时LC流出液经过高温加热而超高速喷雾，产生的离子进入MS，中性分子由真空泵抽走。TS只能获得与分子量有关的信息。在热喷射过程中会使热不稳定化合物分解，在一定程度上被API取代。

3．粒子束（ PB）

利用溶剂与被分析物的动量差分离（与气相色谱／质谱仪上的玻璃喷嘴分离器原理相似），进入质谱后用EI或CI方式电离，优点是能提供传统的EI和CI质谱图。

4．连续流动快原子轰击（CFFAB）

与静态的快原子轰击（FAB）类似。

5．大气压电离（API）（接口与电离相结合）

八十年代后期出现，大气压电离源顾名思义是一种常压电离技术，在大气压下电离，

仅把带电离子“吸入”质谱，不能提供经典的质谱图。目前大气压电离特指：电喷雾（ESI），离子喷雾（IS）和大气压化学电离（APCI）。由于它不需要真空、减少了许多设备，方便使用，而且有下面的优点，因而在近年来得到了迅速的发展。

(1). 由于产生多电荷离子（在ESI和IS下），测定分子量可以达到10万道尔顿以上

(2)．灵敏度达fg-pg

(3)．适用于极性和离子型化合物

(4)．进样方式多样灵活

a）直接流动进样

b）与液相色谱联用

c）与毛细管电泳联用

三．接口原理1．电喷雾电离(ESI)

电喷雾电离是一种“软”电离技术，ESI－MS既可分析小分子也可分析大分子。对于分子量在 1000 Dalton（简写为 Da,现法定计量单位写为u）以下的小分子，会产生[M＋H]+或[M-H]-离子，选择相应的正离子或负离子形式进行检测，就可得到物质的分子量。此外，也可能源内CID生成一些碎片，有利于提供样品分子的结构信息。而分子量高达20，000 u 的大分子在 ESI-MS中常常生成一系列多电荷离子，通过数据处理系统能够得到样品的分子量，准确度优于± 0．01 ％。

(1)．电喷雾机理

电喷雾电离是在液滴变成蒸汽产生离子发射的过程中形成的，这种过程也称为“离子蒸发”，如图2所示。溶剂由泵输送从不锈钢毛细管流出，由于它带3—5kV高压，与对应极之间产生的强电场促使溶剂在毛细管出口端发生喷雾，产生带强电荷的液体微粒，所以称为电喷雾。随着液体微粒中溶剂蒸发，离子向表面移动，表面的离子密度越来越大，最终逸出表面，蒸发进入空间。所以离子形成的过程实际上是在大气压下发生的。

(2)．电喷雾离子源(离子喷雾)Includes IonSpray, TurboIonspray, NanoSpray

图3是电喷雾离子源结构的详细示意图。样品溶液经过内径75um、带 3—4 kV高压的

气作为雾化气抵达探头端口不锈钢毛细管进入离子源，毛细管外有一个同轴套管，通入N

2

的液滴。由于高压和雾化气的作用，使液滴生成含样品与溶剂离子的气溶胶。同时，与喷雾

气，进一步除去溶剂,并有效防止仪器污染,整个电离和除针成一角度还通入加热干燥的N

2

溶剂过程都是在常压下进行。

图3 电喷雾离子源示意图

调节锥体电压可使离子源输出的离子数达最佳条件，它通常以[M＋H]+或[M-H]-是否最佳来衡量。但是，增加锥体电压会加速离子向锥体分离器移动。由于按质谱标准该区域仍处于