HPLC检测功能食品中羟基柠檬酸主成份和两种非法添加药物

减肥功能食品中羟基柠檬酸和非法添加成分的HPLC检测藤黄果提取物中的有效成分羟基柠檬酸(HCA)能够抑制柠檬酸裂解酶的活性，减少体内脂肪的形成，从而达到减肥、降血脂的目的。HCA是一种天然植物提取产物，无毒副作用，因而被广泛应用于减肥食品中。西安源森生物市场调查发现，有部分非法厂商为了提高疗效，将非法化学药物添加入标有HCA/藤黄果提取的功能食品中，为消费者的健康带来了极大的威胁。

最常见的非法添加药物成分是利莫那班和西布曲明：前者能改善脂代谢紊乱，有助降低体重；后者具有明显的抑制食欲作用。与此同时，过量服用带来的肢体痉挛、攻击性、自杀倾向严重，甚至导致心血管疾病等毒副作用不容忽视。

本次实验，西安源森生物采用高效液相色谱法（HPLC）检测功能食品中的HCA及非法添加的利莫那班和西布曲明成分：

一、西安源森生物HPLC检测HCA及非法添加成分的材料与方法

（一）材料与试剂

羟基柠檬酸(HCA 纯度98.70%)；

藤黄果提取物(HCA含量60 %)；

藤黄果减肥功能食品5种(羟基柠檬酸功能食品1–5)；

减肥功能食品4种(市售)；

磷酸(分析纯)；

甲醇(色谱纯)；

西布曲明对照品；

甲醇(色谱纯)；

利莫那班对照品(纯度>98%，TIC)；

(Milli-Q超纯水制备系统)。

（二）仪器与设备

KQ-600B 超声波清洗器；

Agilent 1100高效液相色谱仪；

Milli-Q 超纯水制备系统；

MS2 型漩涡振荡器。

（三）试验方法

1. 储备液的配制

称取HCA对照品10.0 mg→超纯水溶解并稀释→配制成质量浓度为10mg/mL 的标准储备溶液→4℃冰箱保存备用。

称取利莫那班与西布曲明对照品各0.0200g于两个10 mL容量瓶中→甲醇溶解并稀释至刻度→摇匀→得浓度为2mg/mL的对照品储备液→保存在4℃冰箱中。

2. 标准混合工作溶液的配制

量取各对照品储备液各适量，HCA用超纯水逐级稀释成 1.0、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001 mg/mL 的对照品溶液；

利莫那班与西布曲明分别用甲醇稀释制成浓度0.01、0.05、0.1、1、2、5、10、20g/mL系列标准混合溶液。

3. 样品预处理

（1）藤黄果提取物样品处理

取藤黄果提取物50mg置于50mL容量瓶中→加水40mL→超声波发生器上超声提取20 min →冷却至室温→定容至刻度→摇匀→0.22m有机微孔滤膜过滤，供HPLC测定。

（2）胶囊内容物预处理

取5粒胶囊内容物混匀→精密称取0.10g→置250 mL容量瓶→加甲醇200 mL→超声波发生器上超声提取20min→冷却至室温→甲醇定容至刻度→摇匀→经0.22m有机微孔滤膜过滤→供HPLC测定。

（3）样品胶囊壳预处理

任取胶囊5粒→倾出内容物粉末→用棉花擦拭干净胶囊壳→小心地剪成碎片→置50mL容量瓶→加40 mL 50 %甲醇水溶液→超声波发生器上超声提取20min→冷却至室温→加50%甲醇水溶液定容至刻度→摇匀→经0.22m有机微孔滤膜过滤，供HPLC测定。

（4）HPLC 色谱条件

羟基柠檬酸检测:色谱柱: Waters Atlantis T3-(4.6×150mm)；

柱温: 20度；

进样体积: 10L；

流动相: 99% 0.1%磷酸水溶液+1%甲醇；

流速: 0.6mL/min；

检测波长: 210 nm。

利莫那班和西布曲明检测:

色谱柱: Waters At-lantis T3(4.6×150 mm)；

柱温: 20 度；

进样体积: 10L；

流动相: 甲醇；

流速: 0.6 mL/min；

检测波长: 223 nm。

二、西安源森生物HPLC检测HCA含量及利莫那班和西布曲明添加含量实验结果与分析

（一）西安源森生物HPLC检测羟基柠檬酸(HCA)分析

1. 色谱柱和流动相的选择

由于HCA 极性较大，HPLC检测时需要流动相含水比例较高，而且流动相中需加入0.1%磷酸以防止HCA质子化，我们选用适合在低pH范围内和100 %水相兼容的Waters Atlantis T3(4.6×150 mm)柱。

以1mg/mL HCA为研究对象，采用不同比例的0.1%磷酸水溶液–甲醇为流动相进行实验，结果表明以99% 0.1%磷酸1%甲醇为流动相时HCA的仪器相应信号较高，而且保留时间为7.3 min，适合分析实际样品中的HCA的含量。

2. 标准曲线及线性关系

将标准工作溶液在优化色谱条件下进样，以峰面积(A)对HCA对照品浓度(mg/mL)作标准曲线，得线性回归方程。HCA在0.001~1.0mg/mL范围内线性关系良好，其线性回归方程和相关系数见表1。线性回归方程Y=95476X–106，线性相关系数r =1。

3. 检出限测定

根据检测结果HCA的检出限(LOD)为0.1g/mL-(S/N>3)；HCA的定量限(LQD)为0.3 g/mL(S/N>10)。

4. 精密度实验

在相同色谱条件下，取1.0mg/mL HCA对照品溶液重复进样6次，测定各次HCA的峰面积A，计算RSD为0.09 %(n=6)，表明精密度良好。相关数据表2

5. 加标回收率实验

以市售藤黄果提取物和HCA功能食品1为样品，分别添加不同量的HCA 对照品溶液，按本方法进行试验，用HPLC 进行测定。

在低、中、高3个添加水平范围内的平均回收率(每个添加量平行测定6次)为90.49 %~103.90 %，加标回收率结果见表3。

HCA在不同基体中HPLC 谱图如图2所示(其中实际样品以功能食品1为例)。