实验操作注意事项

第二天 2）用接种环挑取一个DH5α单菌落 接种于5mL LB液体培养基中，37℃， 190rpm振荡培养过夜。（12h即可） 第三天 （打冰） 3）将1mL菌液全部转接 到一个含有40mL LB液体培养基锥形瓶中， 37℃，210-250r/min振荡培养2小时。 4）将菌液转移到40mL离心管中，冰上放 置10min以抑制菌生长。（此时打开离心机 预冷，将0.1mol/L CaCl2、80%甘油放在冰 上预冷） 4℃，4000 r/min离心10min，回 收细胞。倒出培养液，将管倒置在灭菌滤 纸上1min，以便使培养液流尽

9.在吸附柱中加入500 μl去蛋白液Buffer DW1，9,000 × g离心30 sec。倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 10.向吸附柱中加入500 μl Wash Solution， 9,000 × g离心30 sec。倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入同一个收集管中。 11.重复步骤10一次 12.将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 × g离心1 min。（此步绝不可省略，否则 残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。）

5）向上述溶液中加入120ul氯仿，盖紧离 心管盖，用手剧烈震荡15s，室温静置5min。 （再次抽滤，保证蛋白质的去除） 6）12,000g4℃离心15min，取上清液（约 450ul）移入另一新的离心管中。 7）向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠 倒充分混匀后，于15~30℃下静置10min。 8）12,000g4℃离心10min。离心结束后， 试管底部会出现RNA沉淀。

感受态细胞的制备（氯化钙法）
准备工作：灭菌：0.1mol/L CaCl2、80%甘 油、2个40mlLB液体培养基（250ml锥形瓶， 方便摇菌 ）、2个5ml液体培养基、一个不 含青霉素的LB固体平板、2个40ml离心管、 滤纸、5ml枪头 第一天 1）将大肠杆菌DH5α菌株接种于LB 固体培养基中，倒置37℃过夜培养（1216h）。（活化细胞制感受态时，培养基不 加抗生素。没有抗生素，细菌长得比较快， 可适当缩短培养时间）
谢谢！

注意：Buffer P3和Buffer DW1中含有刺激 性的化合物，操作过程中要小心。Buffer P2在碱法抽提方法中起非常关键的作用， 其中所含的NaOH很容易因为被空气中的 CO2中和而失效，因此每次使用后一定要密 封保存。 1.挑取单菌落接种于含有2.5ul青霉素的液 体培养基中，37℃ 190rpm振荡培养12-16 小时。 2.保种，915ul菌液+210ul80%甘油 163ul菌液+37ul80%甘油 3.于室温，8,000 × g离心2 min收集剩余 菌体，倒尽或吸干培养基。

4.在菌体沉淀中加入250 μl Buffer P1，吸 打或振荡至彻底悬浮菌体。（一定要彻底 悬浮菌体，否则影响得率和质量。） 5.加入250 μl Buffer P2，立即温和颠倒离 心管5-10次混匀，室温静置2-4 min。（如 果同时操作多个样品，每加入一管混匀一 管，不要采用全部加入一起混匀的方法， 计时从第一管样品加入开始。裂解时间不 宜过长。加入Buffer P2后应温和混匀，如 果剧烈振荡，可能把基因组DNA打断从而 混杂在质粒中。）

PCR产物回收


准备：75℃水浴；检查Buffer DE-B是否出现沉淀， 若出现沉淀，应于70℃温浴加热溶解并冷却至室 温后再使用。 1）在紫外灯下切下含有相应DNA片段的琼脂糖 凝胶，吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量 （提前记录1.5mL离心管重量），该重量作为一 个凝胶体积（100mg=100uL体积）。经验值是小 孔是4个孔约为200mg，中孔是3个孔约为200mg， 大孔是2个孔约为200mg。 2）加入三个凝胶体积的Buffer DE-A（一般是 600ul），混合均匀后于75℃加热，每2-3min混合 一次，直至凝胶块完全熔化（熔化不完全会造成 阻塞回收柱，DNA片段的回收率低，甚至会收不 到目的片段。切胶时尽量切碎）。
转化
1. 取200μL感受态细胞DH5α ，加入10μL 连接产物混匀，冰上放置30min。 2. 42℃热激90s，冰上放置2min。 3. 每管加800μL LB液体培养基恢复培养， 轻轻混匀，37℃，转速为140r /min下温育 1h。 （使菌恢复，青霉素抗性表达）

4. 在含Amp（100μg/mL）的LB固体培养基 表面均匀涂上X-gal（20mg/mL）40μL 和 IPTG(40mg/mL)40μL，静置一会，使平板 充分吸收。 5. 将200μL已转化的菌液均匀涂在培养基平 板表面，放置30min。 6. 倒置平板，37℃培养12～16h。

9)弃上清液，缓慢沿管壁加入75%乙醇1ml （用DEPC处理水配制，切勿触及沉淀）， 轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。 10）12,000g4℃离心5min后小心弃去乙醇。 （为避免影响后续操作，应尽量除去乙醇） 11)室温干燥沉淀2~5min（切勿离心或加热 干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适 量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀 完全溶解后于-80℃保存。RNA溶解时，很 容易降解。最后一步溶解很关键，溶解后 需分装

6.加入350 μl Buffer P3，立即温和颠倒离 心管5-10次充分混匀。（如果起始菌液较 多，混匀后室温静置2分钟以彻底去除 RNA。） 7.于离心机最大转速（≥ 12,000 × g）离心 5-10 min 8.将上清全部小心移入吸附柱，9000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸 附柱放入同一个收集管中。（吸附柱的最 大有效容积为750 μl，如果裂解液较多，可 以重复该步骤直到至所有裂解液流过吸附 柱。）

转化菌质粒的提取
准备工作： 检查Buffer P1中是否已经加入RNase A。 加入RNase A后，Buffer P1请存放于2-8℃ 检查Wash Solution中是否已经加入乙醇。 每次使用前要检查Buffer P2和Buffer P3是 否出现沉淀，如有沉淀，要用37℃溶解沉 淀，待冷却至室温后使用（温度较低，会 出现浑浊，会影响质粒得率）。

3）向上述裂解液中加入200ul氯仿，盖紧离 心管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳 化（无分相现象）后，室温静置5min。 （氯仿沸点低，易挥发，振荡时应小心离心 管盖突然弹开） 4）12,000g4℃离心15min（此时溶液分为 三层，即：上层为透明的水层，RNA溶解在 此层中；半固体状的中间层，此层中包含 DNA；另外有黄色的有机溶剂下层，蛋白质、 多糖等物质溶解在此层），取上清液（约 600ul）移入另一新的离心管中（谨慎操作， 防止吸入白色中间层）。

7）同6，重复一次。 8）将制备管置回2mL离心管中，8000g离 心1min（必须有，否则乙醇残留会影响后 续操作）。 9）将制备管置回1.5mL离心管中，在准备 膜中央加入加热到65℃（能提高洗脱效率） 的25-30uL Eluent 或去离子水，室温静置 10min。12000g离心1min洗脱DNA。 10）将洗脱的含目的片断的Eluent重新置于 膜中央，重复一次洗脱过程。
3）加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DEB（300ul），混合均匀形成黄色溶液，静 置10min。（如果片段小于400bp要加入一 个凝胶体积的异丙醇） 4）将3中的混合液转移到DNA制备管中， 5000g离心1min。弃滤液。（如果液体过多 可离心两次） 5）将制备管置回2mL离心管，加入500uL Buffer W1 5000g离心1min。弃滤液。 6）将制备管置回2mL离心管，加入700uL Buffer W2 5000g离心1min。弃滤液。 （确 保Buffer W2中已加入无水乙醇 ）
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13.在吸附膜中央加入40 μl Elution Buffer （将Elution Buffer预热至60℃可以进一步 提高得率。洗脱液应加在硅胶膜中心部位 以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达 到最大洗脱效率。），室温静置1-2 min， 9,000 × g离心1 min。将所得到的质粒 DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

5）加入预冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮 沉淀（轻轻吹打，使菌液均匀），立即放 在冰上保温30min，使其低渗。4℃ 4 000r/min离心10min，回收细胞。 6）用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞 （务必放冰上）。 7）分装细胞，每200μL感受态细胞一份， 并分别加入终浓度10-15%甘油，-80℃贮存。

连接
10uL的反应体系： pMD18-T Vector（取出放置冰上）1uL 回收的PCR产物 4uL SolutionΙ 5uL 16℃反应过夜（常为16h）。


pMD 18-T Vector和pMD simple18-T Vector由pUC18载体改建而成，它消除了 pUC18载体上的多克隆酶切位点，再在 pUC18载体的多克隆酶切位点处导入了 EcoR V酶切位点，使用EcoR V进行酶切反 应后，再在两侧的3′端添加 “T” 而成。因 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时 都有在PCR 产物的3′末端添加一个“A” 的 特性，所以使用本制品可以大大提高PCR 产物的连接、克隆效率。
实验操作注意事项
RNA提取 PCR产物回收 感受态细胞的制备（氯化钙法） 连接 转化 转化菌质粒的提取

RNA提取
提取RNA所用的耗材如枪头、离心管等要 用DEPC水浸泡过夜，灭菌时要30min 1）取20ml左右对数生长期的盐藻细胞液 （107数量级细胞，太多，细胞裂解不完全， 会有DNA，太少，RNA量不足），8000g 离心2min（温度不宜太低，否则会产生盐 沉淀），弃上清，收集细胞； 2）加入1mlRNATM plus，用移液器吹打重 悬，重复混匀至无明显沉底，转入1.5ml离 心管中，室温静置5min。注：RNATM plus 具有腐蚀作用，并且吸入有害，小心使用。