第十章 转化与筛选

第二节
转化子的筛选与鉴定
一、利用遗传标志的表型特征筛选 二、根据重组子的结构特征筛选
一、利用遗传标志的表型特征筛选
㈠ 由载体提供的性状进行筛选
– 1. 抗菌素抗性标记筛选 – 2. 抗性基因的插入失活筛选 – 3. β-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选 法及其α 互补的原理
㈡ 根据插入基因的遗传性状进行筛选
重组DNA导入宿主细 胞与转化子的筛选
• 第一节 • 第二节 • 第三节
重组DNA向宿主细胞的导入 转化子的筛选与鉴定 目的基因序列测定
第一节
重组DNA向宿主细 胞的导入
一、转化 二、通过接合作用传递质粒DNA 三、通过转染/转导作用传递遗传物质
一、转化 : 以质粒作为克隆载体将目的基因导 入宿主细胞
接合---- F+×F－
Donor
F+
F-
F+
F-
Recipient
F+
F+
F+
F+
三、通过转染/转导作用传递遗传物质
㈠ 转染 病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细 胞（或细菌）的过程称转染。 ㈡ 转导 以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转 导。 原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA, 体外包装成噬菌 体，感染宿主菌，同时导入外源基因。 2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重 组噬菌体DNA导入宿主菌体内
非重组质粒: 不含有插入的 DNA蓝色菌落 重组质粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落
非重组质粒
重组质粒
back
α -互补的原理
所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突 变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2 带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编 码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α 肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性, 进而可分解 底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖 和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。 然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多 克隆位点后, 就会阻断α序列的读码结构, 使其编码的α肽失 去活性, 使重组子所在的细菌不能完成α-互补, 因此带有外 源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种β-半乳糖苷 酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克 隆。此法又称蓝白筛选法。如图5-1
二、根据重组子的结构特征筛选
– 1. 重组子大小鉴别筛选 菌落——提取质粒 ——单酶切——电泳 原质粒 – 2. 酶切鉴定 菌落——提取质粒 ——双酶切——电泳 原质粒 – 3. PCR筛选法 能与插入基因片断两端互补的特异引物, 以 少量抽提的重组子 DNA为模板, 进行PCR分析
– 4. 原位杂交 图5-3、5-4 该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。 – 5. 斑点杂交 1)重组体DNA或RNA抽提出来, 点膜，然后杂交。 2)经提取纯化后, 杂质少, 所以能得到更为确切的结 果, 既可用于定性,也可通过内参照进行相对定量。 – 6. Southern blot杂交法 原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是 否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂 交能将同源片断定位于基因 鉴别法比较：
1928年, 美国的Oswald, Avery 首次开展了肺炎球菌的转 化试验 感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的 状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生，如枯 草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产 生机制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从 周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA, 进而 使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。 常见转化方法有㈠ 原生质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电 穿孔法。
㈠ 原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经 吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。 ㈡ 化学转化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2， 经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。 1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下, 用预冷的 CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体的细胞壁和细胞膜 通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细 菌的细胞内 。 用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形， 外源DNA可形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物而 被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不 被降解，转化效率达105-106，它与菌株（hsdR-). 2.方法 : （1）感受态细菌的制备 （2）转化
二、通过接合作用传递质粒DNA
F质粒（F因子）又称性质粒, 除了含有自我复 制基因外, 还带有一套接合转移的基因, 凡携有F质 粒的细菌称F+菌株。不带有F质粒的细菌称F－菌株。 F+菌株（供体菌）一旦与F－菌株（受体菌）发生接 触，F+菌株可通过性菌毛将F质粒转给F－菌株，使F － 菌株转变成 F+菌株。质粒由F+向F－菌的转移过程 叫接合作用传递质粒, 又称质粒的接合传递。凡带有 在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系 （Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传 递质粒DNA, F+菌株可失去F质粒, F－菌也可获得F质 粒, 其转移难以人为控制,又不稳定， 通常不用作克 隆载体。
同尾酶BamHI和BglII
AGATCT GGATCC TCTAGA CCTAGG BglⅡ BamHI A GATCC TCTAG T4连接酶 G AGATCC TCTAGG
肺炎双球菌转化实验
第三节
目的基因序列测定
一、目的基因序列测定的意义
美国联邦国家人类基因组研究项 目负责人弗朗西斯·柯林斯博士在华盛顿 隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功， 人类基因组计划的所有目标全部实现。由 美、英、日、法、德和中国科学家经过13 年努力共同绘制完成了人类基因组序列图， 在人类揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长 路上又迈出了重要的一步。
裂解细菌或噬菌斑
变性核酸样品
琼脂糖凝胶电泳
变性DNA
将核酸点加到膜上
将凝胶上核酸条带转移 到膜上，同时变性
将核酸固定在膜上→预杂交（消除非特异吸附位点） →加入核素标记探针进行杂交→漂洗膜（洗去非特异 结合探针） →放射自显影或显色反应示踪
全自动DNA测序仪 末端终止法，采用4种荧光染料标记ddNTP， 在同一泳道测序，为人类基因组测序做 出重大贡献。
：
四类核酸分子杂交法的技术路线比较
菌落原位杂交 斑点杂交 Southern印迹 Northern印迹
菌落或噬菌斑转 印到膜上
抽提DNA/RNA
提取DNA
提取RNA
①双脱氧－M13体系DNA序列分析法
M13含单链DNA，在细菌内形成双链环状DNA （RF）。成熟的噬菌体含单链DNA分泌到培 养液中。 双链DNA（RF）：克隆载体，按提取质粒方法 从细菌中制备 单链DNA：测序模板，从培养基的上清中提取
目前常用的M13mp18 图5-6
• ㈡ 化学（裂解）法(如图) 在无NaCl下，用联氨（肼）可打开C、T碱 基，在C、T碱基发生断裂，形成T+C组。加 入NaCl，肼切割C形成C组。在中性条件下， 硫酸二甲酯可在G处断开形成G组。加入甲 酸可在A、G处断开，形成G+A组，最后电 泳经感光读片，自动分析得到测序结果。如、 图5-9 5-10
亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长， 当含 Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选 阳性克隆。
Ampr pBR322
ori
Tcr B
B
X
B
Ampr
B
X
ori B
Ampr
Tcr
ori
Ampicillin
抗性?
yes
yes
Tetracycline 抗性?
No
yes
transfer of colonies
皿
2ul连接液 —— 6ul连接液
冰浴30’
42℃ 2’（热休克）
冰浴，2’
加37℃预热LB培养45’ 表中a、b、c各取100ul/皿 涂 布 （ 连 接 液 转 化 组 d 梯 度 涂 布 I 50ul2 皿 ； II.500ul浓缩后2皿） 37℃倒置培养过夜 检查细菌生长情况
㈢电穿孔法 原理：利用高压脉冲电场, 在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔, 质粒DNA可乘隙而入, 在脉冲过后, 微孔复原 。 它比CaCl2法操作更简单，转化效率高 （一般可达109～1010个转化子／μg DNA）, 不仅无需制备感受态细胞, 而且 适用于任何菌株。
（2）转化： 0℃，在1.5ml离心管中按下表加入
CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验
转化项目
a阳性对照 b阴性对照① c阴性对照② d连接液转化组
CaCl2
—— 10ul —— ——
受体菌
10ul —— 10ul 60ul
DNA
PBR322DNAlng
液体LB
100ul 100ul 100ul 600ul
（1）感受态细菌的制备 接种一环DH5于2ml LB中 37℃，振荡过夜 以约1%的接种量接入20ml LB中 振荡培养约90’至OD600≈0.2 离心（5K，5’） 收集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 冰浴20’ 离心 收集菌体 加入 100ul100mM预冷CaCl2 混匀
二、目的基因测序方法
• ㈠ 酶法——双脱氧链的末端终止法 • ㈡ 化学（裂解）法
酶法——双脱氧链的末端终止法
1. Sanger双脱氧末端终止法：因掺入dd-NTP的链 不能再延长而形成不同长度的末端为A、G、 C、T的片段。图5-5 2. Sanger双脱氧-M13体系测序法：采用M13噬菌 体组装基因后，再由引物合成不同长度末端 为A、G、C、T的片段 图5-6 3 .Sanger双脱氧-PUC体系测序法：类似M13体系， 只是由PUC体系替代M13噬菌体，再由引物 合成不同长度末端为A、G、C、T的片段。 图5-7
+ampicillin
ห้องสมุดไป่ตู้
+ ampicillin + tetracycline
这些克隆是有重组质粒的细菌
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编码b-半乳糖苷酶
lac promoter IPTG X-gal (酶的底物) 蓝色菌落
IPTG可诱导lacZ形成α肽链,该产物能与有缺陷的宿主 细胞所编码的N-末端发生基因内互补，形成有活性的 β-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。 当外源基因DNA片段插入多克隆位点后, 使其编码的α 肽链失去活性, 使其不能形成α-互补, 因此带有外源基 因重组子的细菌形成白色菌落。