耐镉多年生草地早熟禾的转录调控和表达网络对镉胁迫的响应

耐镉多年生草地早熟禾的转录调控和表达网络对镉胁迫的响应
导读
草地早熟禾良好且发达的根系使其具备吸收和积累镉（Cd）的能力，因此在受Cd污染的土壤中具有潜在的植物修复功能。

了解该物种对Cd耐性和积累的分子机制对于通过遗传改良产生新型Cd耐受性品种至关重要，然而目前尚未有充分的文献报道。

本研究对Cd胁迫下草地早熟禾高Cd耐受性基因型（M）和低Cd耐受性基因型（R）的幼苗进行了比较转录组分析。

在M基因型中总共鉴定出7022个上调的转录本和1033个下调的转录本，而在R基因型中仅检测到850个上调转录本和846个下调的转录本。

对M基因型的进一步转录调控分析表明，由于与碳水化合物，脂质和次级代谢以及信号转导相关的多个功能基因的协调，Dof，MADS25，BBR-BPC，B3，bZIP23和MYB30可能是响应Cd胁迫的中枢转录因子。

参与生长素，乙烯，油菜素内酯和ABA信号转导的差异表达基因形成信号转导级联途径，与中枢转录因子相互作用，从而最终协调了与细胞壁和细胞膜稳定性，细胞伸长和Cd耐受性相关的多个基因的表达，包括IAA，ARF，SnRK2，PP2C，PIF，BES1/BZR1，CCR，CAD，FATB，fabF和HACD。

此外，鉴定出了CIPK，MAPK，WAX，UBC和E3泛素连接酶的转录后修饰，并且还参与了植物信号转导途径和非生物抗性。

该研究可能有助于了解草地早熟禾中与Cd耐受性相关的转录调控和复杂的内部网络。

实验设计
结果
1 两种基因型的表型和DEG对Cd胁迫的响应
根据以前的实验数据，研究者选择了两种对Cd胁迫具有不同抗性的草地早熟禾基因型。

加入1000 μM CdCl2后的60天内，大多数M基因型植物虽然生长严重受到抑制，但仍保持绿色，而R基因型植物则枯萎并发黄（图1A）。

Cd的添加使两种基因型的株高显著降低，而R 基因型的株高降低的更多。

在R基因型中，Cd处理的根长显著低于对照，而M基因型没有显著差异。

Cd处理显著降低了两种基因型的地上幼苗重量和根重。

此外，在所有处理中，Cd处理的R基因型的地上幼苗重量和根重最低（图1B）。

为了表征Cd胁迫下两个基因型（R和M）之间的转录组差异，使用RNA测序从四个文库中产生了总计636,831,280个片段。

从头组装产生了478,702个独立基因，平均长度为630.03 bp （表S2）。

来自两个比较的DEG的数目请见图1C。

本研究观察到，Cd胁迫在M基因型中诱导了大量转录本（7022上调和1033下调），而在R基因型中，分别只有850和846转录本被上调和下调。

该结果表明，高Cd耐受性基因型在转录水平上比低Cd耐受性基因型对Cd胁迫的响应更强。

Venn图显示，两种基因型中只有183个（1.9％）转录本受Cd胁迫共调节（图1D）。

进行了qRT-PCR分析以验证转录组数据的置信度，RNA-Seq和qRT-PCR数据之间的Pearson 相关系数（R2）为0.934（表S3）。

该结果表明，无论研究方法如何，在两种草地早熟禾基因型中Cd胁迫诱导的转录调控都是一致的。

图1 Cd胁迫下两种基因型的表型，DEG和Venn图的比较。

（A）Cd处理后60天的表型。

（B）Cd处理后30天的植物生长特征。

（C）在Cd胁迫下第24小时的DEG数量。

（D）维恩图描述了响应Cd胁迫的两个基因型之间DEG的排除和重叠。

R_C，R基因型的浇水良好的对照植物；R_Cd，R基因型的Cd胁迫植物；M_C，M基因型的浇水良好的对照植物；M-Cd，M基因型的Cd胁迫植物。

2 DEG的GO和KEGG分析
图3 M和R基因型的DEG的KEGG途径富集。

高P 值用红色表示，低P 值用绿色表示。

圆圈的大小代表富
集的基因数目。

3 耐受基因型对Cd胁迫的转录调控概述
为了确定M基因型对Cd胁迫的转录调控机制，研究者根据MapMan注释软件对推定的转录调控因子进行了表征。

当搜索针对Bdistachyon_192映射的DEG时，共有202个TF，127个蛋白质降解和119个修饰基因，73个受体激酶，63个激素相关基因，26个钙调节基因，16个G 蛋白和14个氧化还原基因被确定为受Cd添加调节的转录调节因子，强调了它们在响应Cd胁迫中的可能作用（图4）。

图4 Cd诱导的M基因型转录调控概述。

色标表示log2倍数变化值。

4 差异表达转录因子（DET）
进一步分析了用MapMan表征的DET，并将其分为37个家族（图5A，表S4）。

在这些家族中，与bHLH，MYB，AP2/EREBP，Auxin/IAA，ARF和MYB相关的家族被更多的富集，包括23个上调和3个下调的bHLH，22个上调和2个下调的MYB，12个上调的Auxin/IAA家族成员，7个上调和1个下调的AP2-EREPB家族成员，7个上调的ARF。

还值得注意的是，有11个转录本（7个上调和4个下调）被描述为推定的转录调节因子。

此外，总共有26个上调和7个下调的DET仍未分类，可能需要进一步研究。

这些发现表明，耐Cd的植物响应Cd胁迫编排了许多TF。

根据log2（倍数变化）的值，选择17个上调和3个下调的DET作为前20的DET，包括转录MYB，生长素应答蛋白IAA，生长素响应因子ARF和植物色素相互作用因子PIF（表S5）。

前20个DET的KEGG途径富集在植物激素信号转导和转录因子。

图5 TF（A），蛋白质降解基因（B），转录后修饰基因（C），受体激酶（D），植物激素和钙调节基因（E）的数量，在耐Cd基因型的Cd处理植物与对照植物之间的表达水平发生了显著变化。

5 差异表达的受体激酶，蛋白质修饰和降解基因
对参与蛋白质降解的DEG的分析表明，泛素介导的蛋白水解作用（泛素，泛素E2，泛素E3 RING和泛素SCF F盒蛋白）主要是由Cd添加诱导的（图5B，表S6）。

这些结果表明，M 基因型对Cd的耐受性主要与受体激酶蛋白复合物，蛋白磷酸酶和激酶的翻译后修饰以及遍在蛋白介导的蛋白水解有关。

在翻译后修饰的蛋白质中，大多数DEG与促分裂原活化的蛋白激酶
激酶（MAPKK），2C型蛋白磷酸酶（PP2C）钙依赖性蛋白激酶（CPK）和CBL相互作用蛋白激酶（CIPK）有关（图5C，表S7）。

具体而言，类受体胞质激酶VII亚家族中的蛋白质翻译后修饰丰富，包括LRR家族蛋白，LRR跨膜蛋白家族和壁相关激酶。

在受体激酶中，所有63个DEG都可以分为6个亚家族，包括DUF36，杂类，类S-位点糖蛋白，壁相关激酶以及富含亮氨酸重复序列（LRR）III和XI（图5D，表S8）。

DUF36和LRR XI 亚家族非常丰富。

因为大多数类受体蛋白激酶前体和LRR是跨膜蛋白激酶，所以这些蛋白激酶的差异表达表明植物跨膜信号转导的调节与Cd耐受性有关。

6 与植物激素和钙信号转导相关的DEG
与对照相比，Cd处理的植物中激素相关基因的92.1％（58/63）和钙调节基因的88.5％（23/26）被上调（图4）。

最丰富的激素途径是生长素，其次是乙烯和茉莉酮酸酯（JA）。

此外，Cd胁迫诱导了6个上调的ABA，3个上调和1个下调的油菜素内酯相关基因（图5E，表S9）。

差异表达的钙调节基因主要富集在CPK，钙调蛋白结合，钙离子结合和钙转运ATP酶。

这表明参与植物激素和钙信号转导的基因与Cd耐受性有关。

7 DEG的网络分析
通过搜索PlantRegMap数据库，进一步推断出中枢TF和DEG之间的潜在交互作用。

在236个TF和2499个潜在的下游基因之间总共鉴定了15546条调控途径。

在这些TF中，有43个TF在DEG集中产生过表达的目标（在临界p值≤0.05下显著富集）（表S10）。

如图6所示，MADS25（包含MADS-box结构域）与688个下游基因（在所有TF中最丰富）相互作用，其次是包含TF-B3结构域的TF（B3）和包含Dof型结构域的TF（dof）。

MY家族的14个成员与881个下游基因相互作用。

5个包含bZIP域的TF，HBP-1a，bZIP，bZIP23，ABF2和HBP-1b分别与93、81、80、71和22个下游基因相连。

此外，发现5个TCP（TCP20，TCP14，TCP7，PCF2，TCP），2个BES1（BES1，BRZ1）和2个包含bHLH域的TF都能够与30多个差异表达的下游基因相互作用（表S10和S11）。

这些中枢TF及其潜在的下游基因形成了转录调控基因的网络（图6，表S11）。

为了表征潜在的下游基因的功能，通过搜索KEGG数据库进一步分析了1775个与43个富集TF相互作用的基因。

KEGG通路分析表明，有750个DEG（42.3％）被注释到KEGG术语（表S12）。

作者进一步将关键功能基因分为以下几类：碳水化合物代谢，脂质代谢，其他次级代谢物的生物合成和信号转导。

几个TF，包括Dof，MADS25，BBR-BPC，B3，bZIP23和MYB30，与关键功能类别的几乎所有成员进行了相互作用。

其中Dof，MADS25，BBR-BPC和B3是调节参与碳水化合物和脂质代谢的基因的主要TF。

信号转导相关基因主要与Dof，BBR-BPC和TCP20相互作用。

其他次级代谢物组生物合成中潜在的下游基因主要受Dof，MADS25和bZIP23调控。

目前的分析表明，包括Dof，MADS25，BBR-BPC，B3，bZIP23和MYB30在内的几种TF可能在Cd胁迫诱导的代谢和信号转导的转录调控以及潜在的耐受性中起重要作用。

图6 TF和潜在下游基因的调控网络。

每个节点代表一个基因。

红色节点表示富集的TF，绿色节点表示相互作用的基因。

较大和较暗的节点分别表示更重要的富集和更多的连接。

讨论
先前在草地早熟禾中对Cd耐受性的研究筛选出了耐Cd基因型（M），该基因型在Cd胁迫下具有良好的表型和生理特性。

根据转录组分析，本研究检测到与对照相比，Cd处理过的植物中存在许多DEG，这与糖代谢，脂质代谢，其他次级代谢物的生物合成和信号转导的上调或下调有关。

尽管如此，本研究进一步表征了一些Cd响应转录因子，并且参与信号转导和翻译后修饰的基因也可能在调节Cd耐受性中发挥作用。

此外，在本研究中分析了关键TF和潜在的下游基因之间的联系。

响应于Cd胁迫的M基因型的转录调控将在下面讨论。

包括关键代谢途径及其相互作用转录因子的调控，翻译后修饰和蛋白质降解的调控，植物激素代谢和信号转导的转录调控，以及描述草地早熟禾响应Cd胁迫的转录调控网络的假想模型。

1 关键代谢途径及其相互作用转录因子的调控
细胞壁及其膜是植物防御重金属毒性的第一屏障。

本研究表明，在细胞组分术语中，细胞部分，细胞器和膜是最丰富的类别，表明细胞部分和膜的转录调控与草地早熟禾的Cd耐受性有关。

果胶，多糖和细胞壁中的某些蛋白质充当与重金属结合的交换位点，并阻止重金属进入原生质体。

木质素由木质素单体组成，例如香豆醇，芥子醇和松柏醇，它们的生物合成需要一系列不同的酶。

KEGG分析表明，Cd添加诱导了编码咖啡酰-辅酶A O-甲基转移酶[EC：
2.1.1.104]，CCR（肉桂酰辅酶A还原酶），CAD（肉桂基醇脱氢酶）[EC：1.1.1.195]和过氧化物酶[EEC:1.11.1.7]基因的表达（表S12），进而调节对羟基苯基木质素，s型木质素和愈创木基型木素的合成以改善细胞壁。

从东南景天（SaCAD）分离得到的CAD基因的转基因拟南芥植物能够增强Cd的吸收和固定，从而在Cd胁迫下木质化细胞壁，这表明SaCAD在增加Cd 积累和植物耐性中发挥了潜在作用。

植物细胞膜具有流动性，其脂质组成将因各种环境胁迫而改变。

先前的研究发现，膜的不饱和度与许多高等植物对重金属的耐受性密切相关。

在本研究中，KEGG分析表明，参与脂质代谢的DEG受Cd胁迫广泛调节，包括FATB（脂肪酰基ACP硫酯酶B），fabG（3-氧酰基-[酰基载体蛋白]还原酶），fabF（3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]合成酶II），ACSL（长链酰基- CoA 合成酶），ACACA（乙酰基CoA羧化酶/生物素羧化酶1）和HACD（超长链（3R）-3-羟基辅酶A脱水酶）（表S12）。

这些酶参与脂肪酸的生物合成和延伸，以及不饱和脂肪酸的生物合成。

目前对调节网络的分析表明，编码木质素和脂肪酸代谢的酶的DEG可能受Dof，MADS25，
BBR-BPC，B3，bZIP23和MYB30的调节（表S12），因此，转录因子与基因相互作用参与木质素和脂质代谢，保持细胞壁和细胞膜的完整性，可能是草地早熟禾在重金属胁迫下生存的有效策略。

2 通过植物激素代谢和信号转导进行的转录调控
植物激素是植物生长和发育的关键调节剂，并在植物适应和对环境胁迫的响应中起调节作用。

本研究表明，许多编码与IAA，乙烯，茉莉酮酸酯，ABA和油菜素内酯的生物合成代谢和信号通路相关的蛋白质的基因在Cd胁迫下显著上调或下调（图5E）。

Aux/IAA和生长素应答因子（ARF）转录因子家族是植物生长素信号转导的关键组分。

功能丧失的突变体iaa3与侧根形成和植物生长素稳态相关。

在水稻中，OsIAA23对于由生长素信号传导途径介导的静止中心的胚后维持至关重要。

目前的分析表明，Cd添加会引起IAA3，IAA8，IAA14，IAA16，IAA17
和IAA33的上调。

此外，检测到7个ARF成员的上调（图S8）。

已经证明生长素信号传导参与调节植物的生长和发育以及对环境胁迫的抗性。

AUX1（生长素运入载体），IAA（生长素响应蛋白），GH3（生长素响应GH3基因家族）和SAUR（SAUR家族蛋白）是生长素信号传导的关键组分。

它们均在Cd处理的植物中差异表达，并被鉴定为潜在的BBR-BPC和Dof下游基因（表S12）。

这表明在耐Cd的植物中，生长素信号传导主要与Cd胁迫下更好的生长表现有关。

植物色素相互作用因子（PIF）是含bHLH基序的TF，在植物色素（PHY）介导的光信号转导中起关键作用。

许多内源性植物激素（赤霉素，生长素，乙烯）和环境因素（光照，高温）在调节各种形态发生反应中与PIF活性相交。

以前的发现表明，PIF与BES1（BRI1-EMS-抑制因子1）和BZR1（芸苔素唑抗性1）协同作用，在激活油菜素内酯信号转导中起进一步作用。

BZR1和BIM2（与BES1相互作用的类Myc蛋白2）在Cd胁迫下Cd耐受基因型中上调。

根据调控网络分析，BZR1和BES1分别与50和39个下游基因相连（图6，表S11）。

据报道，乙烯
可以通过EIN3/EIL1（乙烯不敏感型3/EIN3-Like1）激活PIF3或ERF1（乙烯响应因子1）途径，并且一个推定的BZR-ARF-PIF-ERF模块用于调节拟南芥的胚轴伸长。

在Cd处理过的植物中检测到与ERF相关的DEG，并通过调节网络分析发现许多关键的下游基因与ERF和EIN3相互作用（表S4，表S11）。

在拟南芥的乙烯不敏感突变（ein2-1）中观察到对Cd胁迫的耐受性增加。

此外，PIF可能与BES1/BZR1协同调节生长素的合成和信号转导，然后协调与细胞扩增相关的几个基因。

本研究发现PIF3和PIF4在Cd处理过的植物中差异表达，并被预测为MADS25和MYB30的潜在下游基因（表S12）。

该结果可能表明PIF与生长素，乙烯和油菜素内酯的串扰与MADS25和MYB30相互作用，响应Cd胁迫协调细胞伸长。

耐Pyrabactin的和相关的（PYR/PYL）受体，PP2C，SnRK2和ABA响应元件（ABF/AREB/ABI5）是ABA信号转导的主要因素。

据报道，暴露于渗透胁迫时ABA会迅速在根部积累，然后PYR/PYL 失活PP2C的活性，使蛋白质磷酸化并随后激活SnRK2蛋白激酶，从而激活其下游靶标
ABF/AREB/ABI5。

在本研究中，参与PP2C和SnRK2的DEG被分别鉴定为一个bHLH域TF和TCP20的潜在下游基因（表S12）。

在蛋白质翻译后修饰分析中，还发现了与PP2C和SnRK2相关的DEG（表S7）。

根据调控网络分析，ABF2与71个下游基因相连（图6，表S12）。

GhABF2的过表达显著提高了拟南芥和棉花的耐旱性。

这些发现表明，bHLH和TCP20与PP2C和SnRK2的结合可能在ABA途径中Cd介导的转录调控中起关键作用，从而诱导胁迫响应。

3 翻译后修饰和蛋白质降解的调控
CIPK是钙调磷酸酶B类蛋白（CBL）的靶标，其是参与胁迫诱导的Ca2+信号转导的Ca2+传感器蛋白。

CBL-CIPK网络调节其下游基因，以诱导对不利环境条件的一系列生理和生化反应。

CIPK和钙依赖性蛋白激酶（CDPK或CPK）可以作为与ABA信号转导相关的调节剂。

在本研究中，许多参与蛋白质翻译后修饰的DEG与CIPK（CIPK2，CIPK5）和CPK（CPK13，CPK7，CPK6，CPK2）相关（表S7）。

在钝稃野大麦中，表征了12个HsCIPK基因的转录表达水平受到Cd毒性的调节，多个HsCIPK的水稻转基因植株在Cd胁迫下表现出更高的根系生长能力。

作者推测CIPK和CDPK的翻译后调控可能与草地早熟禾对Cd的耐受性有关，需要进一步的功能分析来检验这一假设。

在ABA信号通路中，PYR/PYL失活PP2C的活性，使蛋白质磷酸化并随后激活SnRK2蛋白激酶，从而激活其下游靶标ABF/AREB/ABI5。

在M基因型的DEG中也观察到了PP2C 和SnRK2的翻译后修饰（表S7）。

此外，与对照植株相比，其他编码与翻译后修饰相关的蛋白质的DEG，例如MAPKKK（MAPKKK5，MAPKKK15，MAPKKK16，MAPKKK17）和WAK（WAK2，WAK3）在Cd处理植物中上调和下调。

据报道，MAPKKK5和MAPKKK17在小果野蕉中受到非生物胁迫的转录调控。

细胞壁关联的受体蛋白激酶124（OsWAK124）的转基因水稻幼苗对重金属毒性（Al，Cu和Cd）的抵抗力更高，表明WAK在响应环境重金属胁迫中发挥作用。

蛋白质降解分析表明，Cd处理可在很大程度上诱导泛素介导的蛋白水解作用（图5D）。

在植物中，泛素化是一个特征明确的翻译后修饰，是泛素-26S蛋白酶体途径中选择性蛋白水解级联的关键调控过程。

已知在植物生长和发育过程中调节很多的细胞功能，例如光形态建成，花发育，光和植物激素信号转导以及对环境胁迫的响应。

蛋白质泛素化的过程通过三个酶级联介导，包括E1泛素激活酶（UBA），E2泛素结合酶（UBC）和E3泛素连接酶。

在这些酶中，
E2不仅参与泛素化，而且在泛素化途径中起调节剂的作用。

在本研究中，作者发现在耐受基因型中，Cd的施用会上调一个UBC（UBC22）（表S6）。

在龙眼中，DlUBC的表达水平对非生物胁迫敏感，这可能在胁迫耐受性中发挥重要作用。

烟草中NtUBC1的过表达调节Ca积累和氧化应激响应，从而提高Cd耐受性。

在拟南芥中，UBC1/UBC2与E3（HUB1/HUB2）协同作用来调
节H2B泛素化，这直接与诱导花卉阻碍蛋白基因有关。

在本研究中还发现了HUB2的差异表达（表S6）。

许多E3泛素连接酶在Cd胁迫下的M基因型中差异表达，例如BPM1（BTB-POZ和MATH结构域1），BPM2，BT2（BTB和TAZ域蛋白2），HUB2（组蛋白一元泛素化2），锌指（C3HC4型环指）家族蛋白和F-box家族蛋白（FBW2）。

该结果表明，E3泛素连接酶可能在草地早熟禾的耐Cd基因型中对Cd胁迫的响应中起作用；但是，这些酶在植物对Cd的耐受性中的特定功能仍需要进一步研究。

4 描述草地早熟禾响应Cd胁迫的转录调控网络的假设模型
根据目前的分析，由于调节了多个功能基因，Dof，MADS25，BBR-BPC，B3，bZIP23和MYB30可能是草地早熟禾对Cd耐受的关键参与者（图7）。

这些关键TF与许多中枢TF和其他代谢途径相关的基因直接或间接相互作用，随后引起信号转导并激活/抑制碳水化合物，脂质和次级代谢中的多种下游基因。

因此，本研究提出了一个模型来描述草地早熟禾响应Cd胁迫的转录调控网络。

首先，关键TF（MADS25和MYB30）与PIF3和PIF4相互作用，然后PIF激活BES1和BZR1的表达，进一步协调BR信号的整合。

此外，PIF和BES1/BZR1可能共同作用以激活生长素和乙烯的合成和信号转导途径，并协同激活参与细胞扩增的基因。

BBR-BPC，Dof，bHLH 和TCP20还可以通过调节IAA，ARF，SnRK2和PP2C的表达直接激活生长素和ABA信号转导，从而介导抗逆性。

信号转导级联和中枢TF最终协调了与细胞壁和细胞膜，细胞伸长和Cd抗性相关的多个基因的表达，包括IAA，ARF，SnRK2，PP2C，PIF，BES1/BZR1，CCR，CAD，FATB，fabF和HACD。

此外，Cd胁迫介导的CIPK，MAPK，WAX，UBC和E3泛素连接酶的转录后修饰可通过对Cd胁迫的信号感知和转导触发非生物抗性相关基因的激活，例如CIPK2，MAPKKK15，MAPKKK17，WAX2，UBC22和HUB2。

图7 Cd胁迫下草地早熟禾叶片中发生事件的假设模型。