大肠菌群

大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。

1 设备和材料
1.1 温箱：36±1℃。

1.2 冰箱:0～4℃。

1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。

1.4 天平。

1.5 显微镜。

1.6 均质器或乳钵。

1.7 平皿:直径为90mm。

1.8 试管。

1.9 吸管。

1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。

1.11 玻璃珠:直径约5mm。

1.12 载玻片。

1.13 酒精灯。

1.14 试管架。

2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。

2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。

2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。

2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。

2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中
3.22规定。

2.6 生理盐水。

2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。

3 操作步骤
3.1 检样稀释
3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。

固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。

3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。

3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。

3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。

3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。

每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。

3.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。

3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。

凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

4 粪大肠菌群(faecal coliform)
4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。

4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN 值。

进入无菌室步骤
1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。

5—1小时。

2．关灯后0•5小时后放可进入。

3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套
实验步骤
1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。

（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）
2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。

3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）
4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）
5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液
7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。

琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。

盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。

）
10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H ＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）
11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成
－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成
－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样
12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。

（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。

所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）
13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。

14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。

（方法见标准）15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。

16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。

5小时同时不能放气。

第一法大肠杆菌MPN 计数
操作步骤
6.1、样品的稀释
6.1.1、固体和半固体样品：以无菌操作取259 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液
的无菌均质杯内，8000r / min ～1000r/ min 均质1 min～2 min ，制成l:10 样品匀液，或置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。

6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。

6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5～
7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1mol/L 盐酸（HCI）调节。

6.1.4、用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其棍合均匀，制成1:100 的样品匀液。

6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。

每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。

6.2、初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。

每个稀释度接种3 管月桂基磺酸盐胰蛋白陈（LST ）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）。

36℃±1℃培养24h±2h ，观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。

记录在24h～48h 内产气的LST 肉汤管数。

如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行复发酵试验。

6.3、复发酵试验
用接种环分别从所有培养48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中取培养物1 环，移种于已提前预温至45 ℃的EC 肉汤管中，放人带盖的44.5℃±2 ℃水浴箱内。

水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h ，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h ±2h 。

记录在24h 和48h 内产气的EC 肉汤管数。

如所有EC 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行EMB 平板分离培养。

6.4、伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB 平板，36 ℃±1 ℃培养18h～24h 。

检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

6.5、营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。

用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 ℃±1 ℃，培养18h～24h 。

取培养物进行革兰氏染色和生化试验。

6.6 、生化试验
6.6.1、靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，36 ℃±1℃培养24h±2h 后，加Kovacs 靛基质试剂0.2 mL～0.3 mL ，上层出现红色为靛基质阳性反应。

6.6.2 、MR -VP 试验：将培养物接种MR -VP 培养基，36 ℃±1 ℃培养48h±2h 。

移取培养物1mL至13 mm×100mm 试管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氢氧化钾溶液0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h ，如出现伊红色，为VP 试验阳性。

将MR 一VP 培养液的剩余部分再培养48h 后滴加5 滴甲基红指示剂。

培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。

6.6.3、柠檬酸盐利用试验：将培养物接种Koser 氏柠檬酸盐肉汤，36℃±1 ℃培养96h±2h,记录有无细菌生长。

6.7、大肠杆菌MPN 计数的报告
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为＋＋- -或-＋- -。

只要有1 个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST 肉汤管即为大肠杆菌阳性。

依据LST 肉汤阳性管数查MPN 表，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌MPN 值。

第二法大肠杆菌VRB - - MUG 平板计数法
8、样品稀释
按6.1 进行。

9、检验
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1 mL 注人两个无菌平皿。

另取1 mL 稀释液注人一个无菌平皿中，作空白对照。

将45 ℃±0.5 ℃的VRB 琼脂10 mL～15 mL 倾注于每个平皿中。

小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。

待琼脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG 琼脂覆盖平板表层。

凝固后翻转平板，36 ℃±1 ℃培养18h～24h 。

选择菌落数为10～100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。

检验时用已知MUG 阳性菌株（如大肠杆菌ATCC 25922 ）和产气肠杆菌（如ATCC 13048 ）做阳性和阴性对照。

10、大肠杆菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。

第三法大肠杆菌PetrifilmTM 测试片计数法
12、样品稀释按6.1 进行。

13、检验
13.1、接种和培养
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。

将测试片置于平坦实验台面，。

揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1ml匀液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，将压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样品匀液均匀覆盖于圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。

拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。

将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20 片，36℃±1 ℃培养。

肉、家禽和水产品，培养时间为24h±2h；其他食品，培养时间为48h±2h 。

13.2、判读
可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM 自动判读仪计数。

蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。

圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。

当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品匀液，重新检验。

14 大肠杆菌测试片计数的报告
选择菌落数在15～150 之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。

如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1 乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150 ，计数最高稀释度测试片上
的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

计数菌落数大于150 个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 ，即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20 cm " ）。

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

中文名大肠杆菌;大肠埃希氏菌外文名Escherichia coli 属埃希菌属种大肠埃希菌
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。

调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。

粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。

[1]
由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。

国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。

两个标准方法在检测程序上略有不同。

（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。

乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。

36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。

证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。

同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。

报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN 值。

具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》
现行有效新国标：
（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。

本方法采用两步法：
推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。

36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

以BGLB产气为阳性。

查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN 值。

具体操作参见SN0169-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》[1]
MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。

这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最相近似的数值。

MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。

注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。

无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。

有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。

因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。

在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。

实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。

如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。

由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。

国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。

另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。

所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。

大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。

抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。

国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。

抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。

有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。

[1]
需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性、不生芽孢、在37°C培养24小时内使乳糖发酵产酸产气的杆菌。

有的国家把培养温度定为35°C，也有把培养时间定为48小时内的。

用大肠菌群作为水质的指示菌的原因有：①在人粪中大量存在，因此在为人粪所污染的水体中容易测到；②检验方法比较简便；③对氯的抵抗力相似于致病的肠道细菌。

可以认为：消灭了大肠菌群，致病肠道细菌也已消灭，水可供饮用。

大肠菌群的检验方法有两种：①发酵法。

以不同量水样接种于规定数目的含有不同量标准培养基的发酵管中，在37°C经24小时培养后，如发酵管产酸产气、显微镜检验又为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则为阳性反应。

根据培养和阳性的发酵管数目，按统计学原理即可得出大肠菌群数(每升或每100毫升中的个数)。

因为数目是按统计学原理算出的,故称最可能数(MPN)。

②滤膜法。

水样通过滤膜过滤，因膜的孔径很小，大肠菌群截留在膜上。

将滤膜移到远藤氏培养基上，在37°C经24小时培养后直接数典型菌落数，即得结果。

由于滤膜要具有标准的孔径，以及操作上所需的技术要求较难掌握，滤膜法的使用还不普遍。

两种方法所得结果不可比较。

1976年中国颁布的生活饮用水水质标准规定，每升水中大肠菌群不超过3个。

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。

一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。

大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

大肠杆菌的检测及原理
1.检测原理：
大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。

2.仪器设备与器具：
2.1 恒温培养箱：36±1℃。

2.2 1000ml三角烧瓶、1ml、10ml移液管。

2.3 接种针。

2.4 显微镜。

2.5 超净工作台。

2.6 玻片、酒精灯、洗耳球、试管架。

2.7 天平：感
量0.01g。

2.8 灭菌釜。

2.9 培养皿（直径为90mm）、试管，经121℃、30分钟灭菌。

2.10试管夹、酒精灯、秒表、载玻片
3.培养基及试剂：
3.1 乳糖胆盐发酵管：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。

3.2 伊红美兰琼脂平
板：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。

3.3 乳糖发酵管：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。

3.4 革兰氏染色液。

3.4.1 结晶紫染色液：结晶紫1g 95%乙醇20ml 1%草酸铵水溶液80ml 将结晶紫溶解
于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

3.4.2 革兰氏碘液：碘1g 碘化钾2g 蒸馏水300ml 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 ml。

3.4.3 沙黄复染液：沙黄0.25g 95%乙醇10ml 蒸馏水90ml 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

3.5 生理盐水。

4.检验程序：
检样
稀释
↓
乳糖胆盐发酵管，36±1℃，24±2hr
↓
不产气
产气
↓
大肠菌群阴性
伊红美兰琼脂平板，36±1℃，24±2hr
报告
↓ ↓
革兰氏染色
乳糖发酵管，36±1℃，24±2hr
↓ ↓ ↓
G+ G-，无芽孢杆菌
产气
不产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阴性
报告
大肠菌群阳性
报告
5.测定方法：
5.1 检样稀释：
5.1.1 以无菌操作将检样
25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中，经充分振摇成1：10均匀稀释液。

5.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管中，振摇成1：100稀释液。

5.1.3 重复5.1.2的操作，使成1：1000稀释液。

5.2乳糖胆盐发酵试验：根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择二个稀释度，每一稀释度接种3管，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管。

1ml 及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。

然后置于36±1 ℃培养箱内，培养24±2hr，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则可按以下程序进行。

5.3分离培养：将产气的发酵管分别接种于伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养24hr后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色。

5.4证实试验：在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管，置于36±1℃温箱内培养24±2hr，观察产气情况。

乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

5.5报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。