吴茱萸不同炮制品对人正常肝细胞L02的体外肝毒性研究

第 35 卷 第 10 期 2017 年10 月
中华中医药学刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 35 No． 10 Oct． 2 0 1 7
DOI： 10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2017． 10． 051
响，采用倒置显微镜观察细胞形态学改变，并测定细胞培养上清液中谷丙转氨酶（ ALT） ，谷草转氨酶（ AST） 和乳
酸脱氢酶（ LDH） 的含量。结果： 与阴性对照组比较，阳性药组、生吴茱萸组可明显降低 L02 细胞的活性 （ P ＜
0. 01） 与形态，显著升高 L02 细胞培养上清液中 ALT、AST、LDH 活力（ P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05） ； 与生吴茱萸组比较，甘
素混合 液 （ 批 号： 20160422 ） 、磷 酸 盐 缓 冲 液 （ PBS，批 号： 24 h 后换液，每孔加入 200 μL 配好的不同浓度的生吴茱
20160301） 、Cell Counting Kit － 8 （ CCK － 8，批 号： 萸、甘草制吴茱萸、盐吴茱萸各供试品溶液，质量浓度分别
通讯作者： 刘舒凌（ 1982 － ） ，女，广西桂林人，讲师，硕士，研究方 载本品温燥而有小毒［3］。近年来，临床上因服用了未制透
向： 中药炮制原理研究。E-mail： 79吴茱萸，或因超剂量服用而产
第 35 卷 第 10 期 2017 年10 月
Key words： Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth； processing； in vitro； hepatotoxicity
中
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 Evodia rutaecarpa （ Juss． ）
华
中 医 药
收稿日期： 2017 － 05 － 12 基金项目： 广西高校科学技术研究项目（ KY2015LX149） ； 广西中医
正常肝细胞 L02 的毒性差异，以期为阐明吴茱萸炮制减毒 的原理提供实验依据。
℃ 水浴锅上挥干浓缩成浸膏，用 DMSO 溶解，定容于 25 mL 容量瓶中，制得以生药计 0． 5 g·mL － 1 药液，4 ℃ 冰箱保存，
1 材料
用前以完全培养液配制所需的最高浓度后，再以完全培养
1． 1 仪器
液倍比稀释制得其余浓度，0． 22 μm 微孔滤膜滤过除菌，即
20160422） ，以上试剂均够自 Solarbio； 胎牛血清（ FBS，MULTICELL，批号： 086110037） ； ＲPMI － 1640 完全培养基（ Hy-
制前后对肝细胞的毒性作用如何，国内外尚无报道。因此， 分别称取生吴茱萸、甘草制吴茱萸、盐吴茱萸粉末各 12． 5 本文拟以吴茱萸现行的主要炮制品种［1，10］（ 吴茱萸、制吴茱 g，加入 10 倍量 70% 乙醇超声提取两次（ 功率 200 W，频率
萸和盐吴茱萸） 为研究对象，比较吴茱萸不同炮制品对人 40 kHz） ，每次 1 h，合并两次所得滤液，减压回收乙醇，50
密称取对乙酰氨基酚 0． 0302 g，置于 10 mL 容量瓶中，加入 细胞培养液溶解定容至 10 mL，摇匀，制成 20 mmol· L － 1 （ 相当于 3． 02 g·L － 1 ） 对照品溶液，用前 0． 22 μm 微孔滤
（ 昆山市超声仪器有限公司） ； SQP 分析天平（ 赛多利斯科 膜过滤除菌，即得。
实验动物有致肝损伤的作用，吴茱萸经口给药后，主要的毒 性靶器官为肝脏 ［6 － 9］。传统中医药理论认为，吴茱萸通过
热锅中，文火加热，炒至裂开，稍鼓起时，取出，晾凉。将上 述吴茱萸各炮制品，打粉过 2 号筛，备用。
合理地炮制，能起到减毒增效的作用。迄今为止，吴茱萸炮 2． 1． 2 样品的制备 吴茱萸各炮制品供试品溶液的制备：
学仪器（ 北京） 有限公司） ； PYX － 190H － B 恒温孵育箱（ 韶 2． 2 CCK － 8 法测定吴茱萸不同炮制品对 L02 细胞的毒
关市科力实验仪器有限公司） 。
性
1． 2 试剂 0． 25% － EDTA 胰消化酶（ 批号： 20160420） 、青、链霉
取对数生长期的 L02 细胞，消化后重悬调整细胞密度 为 4 × 104 个 / mL，每孔 200 μL 细胞接种于 96 孔板中，接种
SW － CJ － 1FD 超净工作台（ 苏州净化设备有限公司） ； DMI3000B 倒置显微镜（ LEICA） ； 1312004047 全波长酶标仪
得。 阳性药（ 对乙酰氨基酚） 供试品溶液的制备［11 － 12］： 精
（ TECAN） ； 5430Ｒ 冷冻低速离心机 （ EPPENDOＲF） ； DW － 86L626 超低温保存箱（ 青岛海尔特种电器有限公司） ； MCO － 18AIC 恒温二氧化碳培养箱（ SANYO） ； KQ5200B 超声仪
草制吴茱萸组、盐吴茱萸组可显著降低对 L02 细胞的增殖抑制作用（ P ＜ 0. 01） 与形态变差的趋势，显著降低 L02
细胞培养上清液中 ALT、AST、LDH 活力（ P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05） 。吴茱萸各炮制品体外对 L02 细胞的毒性作用顺序
为： 生吴茱萸 ＞ 甘草制吴茱萸 ＞ 盐吴茱萸。结论： 生吴茱萸、甘草制吴茱萸、盐吴茱萸体外对 L02 细胞具有毒性作
用，炮制可降低吴茱萸的体外肝毒性作用。
关键词： 吴茱萸； 炮制； 体外； 肝毒性
中图分类号： Ｒ285． 5
文献标志码： A
文章编号： 1673-7717（ 2017） 10-2664-06
Study on Hepatotoxicity of Different Processed Products of Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth on L02 Human Normal Liver Cells in Vitro
广西中医药大学自然科学研究项目（ YB14005）
味辛、苦、热，有小毒，归肝、脾、胃、肾经，能散寒止痛，降逆
学
作者简介： 张晟瑞（ 1990 － ） ，男，广西桂林人，硕士研究生，研究方
止呕，助阳止泻［1 － 2］，用于厥阴头痛，寒湿脚气，寒疝腹痛，
刊
向： 中药药效筛选与中药新药研发。
经行腹痛，脘腹胀痛以及五更泄泻等。历代中医药文献记
吴茱萸不同炮制品对人正常肝细胞 L02 的体外肝毒性研究
张晟瑞，刘舒凌，钟振国，曾春晖，吴燕春，黄玉冲
（ 广西中医药大学，广西 南宁 530001）
摘 要： 目的： 比较吴茱萸不同炮制品体外对人正常肝细胞 L02 的毒性作用，初步探讨吴茱萸炮制减毒的原
理。方法： 以人正常肝细胞 L02 细胞为研究对象，采用 CCK － 8 法检测吴茱萸不同炮制品对 L02 细胞活性的影
ZHANG Shengrui，LIU Shuling，ZHONG Zhenguo，ZENG Chunhui，WU Yanchun，HUANG Yuchong
（ Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，Guangxi，China）
Abstract： Objective： To compare the virulence of different processed products of Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth on L02 human normal liver cellsin vitro and study the attenuation of Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth in different processed ways． Method： Take L02 human normal liver cells as research object and test the effect to activities of L02 cells with the method of CCK － 8 by processing Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth in different ways． Observe the change of cell morphology with inverted microscope and determine the content of alanine aminotransferase （ ALT） ，aspartate aminotransferase （ AST） and lactate dehydrogenase （ LDH） in culture supernate． Ｒesult： Compared with the negative group，the positive group and raw product group of Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth can obviously reduce the activities of L02 cells（ P ＜ 0. 01） and morphology． Additionally，the activities of ALT，AST and LDH were promoted markedly （ P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05） ． Compared with the raw product group of Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth，glycyrrhiza processed group and salt processed group can observably inhibit the proliferation of L02 cells（ P ＜ 0. 01） and the trend on morphological deterioration． Moreover，the activities of ALT，AST and LDH were obviously decreased（ P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05） ． The toxic effects of different processed products of Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth on L02 cells in vitro was the raw product ＞ the glycyrrhiza processed ＞ the salt processed． Conclusion： The raw products，glycyrrhiza processed products and salt processed products of Evodia rutaecarpa （ Juss． ） Benth were toxic of L02 cells in vitro and hepatotoxicity could be reduced by processed．