胡桃醌对白血病细胞增殖的抑制作用
胡桃醌对人肝癌BEL-7402细胞增殖和膜流动性的影响
・基础 医学研 究 ・
胡 桃 醌 对 人肝 癌 Ｂ Ｌ ７ ０ 胞 增 殖 Ｅ 一４ ２细 和膜 流动 性 的影 响
陈 丽 那顺巴雅 尔 张 建 于 娟 顾为望
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摘 要 ： 目的 ： 研究胡桃醌诱导人肝癌 Ｂ Ｌ７ ０ Ｅ －４ ２细胞凋亡及其作用机制。方法： 采用 ＭＴＴ法测定细胞生长抑制 率， 通过 流式
浓度胡桃醌均可引起 Ｂ Ｌ７ ０ Ｅ ４ ２细胞膜的 ｒ Ｐ和 值显著性降低（ ＜０ ０ ）尤其在前 １ ｉ ｒ Ｐ、 、 Ｐ ．５ ， ｎ内 、 值下降迅速 ，ｒｉ ａ ｒ １ ｎ后各指标下 ａ 降的趋势渐渐平缓 。结论 ： 胡桃醌能显著增加 Ｂ Ｌ７ ０ Ｅ －４ ２细胞的膜 流动性 ， 促进其 本身进入细胞 内部 ， 抑制细胞 的增 殖 ， 诱导细胞 凋
细胞仪观察 凋亡细胞 ， 采用荧光偏振技术离体动态地检测 ３ ｉ ０ｒ ｎ内胡桃醌对 Ｂ －４ ２细胞各 向异性 ｒ 荧光偏振度 Ｐ和微粘度 的 ａ ＥＬ７ ０ 、
影 响 ， 析 细 胞 膜 流 动 性 的 改变 。结 果 ： 浓 度 的 胡桃 醌 均 可 抑 制 人肝 癌 Ｂ Ｌ ７ ０ 分 各 Ｅ 一４ ２细胞 的生 长 ， 导 其 凋亡 ，Ｃ ｏ １ ． ８ Ｍ 。不 同 诱 Ｉｓ为 ３ ７ｔ ￣
天津 市灏洋 生物制 品科 技有 限责任 公 司， ｏ： ２ ０ Ｙ。二 Ｌ ｔＴＥ ０ ４ 甲基 亚砜 （ ＤＭＳ ： 自 ｓ ｍａ Ｌ ｔＤ ８ ９ 常 温避 光 保存 。 Ｏ） 购 ｉ ， ｏ： ５７ ， ｇ
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海 克 隆 生 物 化 学 制 品有 限 公 司 ， ｏ ： ￣ Ｏ ５ ， 用 前 每 Ｌ ｔＮ Ｊ Ｏ８ 使 ５０ 培养基分别加入 １ 的 Ｆ Ｓ ５ ５ 青霉素／ ０ ｍｌ Ｏ Ｂ ，． ｍｌ 链霉素液 ，
胡桃醌对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用研究
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１ ． １ Ｍ ｒ ｌ Ｔ 法检测胡桃醌 对 ＭＣ Ｆ 一 ７细胞的增殖抑制作用 。方法 Ａ Ｊ ｕ ｇ ｌ ｏ ｎ ｅ（ ５￣ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） ； Ｂ Ｊ ｕ ｇ ｌ ｏ ｎ ｅ（ １ ０￣ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ） ； Ｃ Ｊ ｕ ｇ ｌ ｏ ｎ ｅ（ ２ ０ ｉ ￣ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ） ； Ｄ Ｊ ｕ ｇ ｌ ｏ ｎ ｅ 参见嗍 ， 酶标 仪在检测波长 为 ５ ７ ０ ａ ｍ 条件下测 吸光度（ Ａ） 值， 计算 （ ５ ￣ ｉ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ） ＋ Ｎ Ａ Ｃ； Ｅ Ｊ ｕ ｇ ｌ ｏ ｎ ｅ（ １ ０ ｉ ｘ ｍｏ Ｙ Ｌ ）＋ Ｎ Ａ Ｃ ； Ｆ Ｊ ｕ ｇ ｌ ｏ ｎ ｅ（ ２ ０ ｉ ￣ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ）＋ Ｎ Ａ Ｃ ； Ｇ
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１ ８・
科 技 论 坛
胡桃 醌对人乳腺癌 ＭＣ Ｆ － ７ 细胞增殖抑制作用研究
辛 国松 ’ 季宇彬 ’ 李先 明 ’ 曹明哲 王永祥 ’ 孙艳ห้องสมุดไป่ตู้ ’
（ １ 、 哈 尔滨 商业大学 生命科学与环境科 学研究 中心 ， 黑龙江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ７ ６
２ 、 国家教 育部 抗 肿瘤天然 药物工程研 究 中心 ， 黑龙 江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ７ ６ ） 摘 要： 目的： 研究胡桃 醌诱导人乳腺 癌 ＭＣ Ｆ 一 ７细胞凋亡及其形态学观察 。方法 ： 四甲基偶氮唑蓝（ Ｍ１ Ｔ ｒ ） 法检测胡桃醌对 ＭＣ Ｆ 一 ７细 胞的增殖抑制作用 ； Ｈ ｏ ｃ ｈ ｅ ｓ ｔ ３ ３ ２ ５ ８荧光染 色法观察 细胞 凋亡形态 ； 流式细胞术（ Ｆ Ｃ Ｍ） 检 测细胞凋亡率。 结果 ： 胡桃醌对人 乳腺癌 ＭＣ Ｆ 一 ７细 胞的 Ｉ Ｃ ５ ０为 １ １ ． ９ ９ ｐ ． ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ； 胡桃 醌作 用 ２ ４ ｈ 后， 细胞生长密度 变疏 ， 细胞 皱缩 ， 出现 凋亡 小体 ， 且 随着给药浓度 升高， 凋亡小体也逐渐增 多 ； 胡桃醌 ５ 、 １ ０ 、 ２ ０ １ ｘ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ作用 ２ ４ ｈ 后 ＭＣ Ｆ 一 ７细胞凋亡率分别为 ６ ． ３ ５ ％、 １ ２ ． ４ ３ ％、 ２ ８ ． ５ ５ ％。 Ｗｅ ｅ ： 胡桃 醌对人乳腺癌 Ｍ Ｃ Ｆ 一 ７细胞具有增 殖抑
抗白血病药抑制白血病细胞生长治疗白血病使用说明详解
抗白血病药抑制白血病细胞生长治疗白血病使用说明详解白血病（Leukemia）是一种以异常增殖和形成恶性白细胞为特征的血液系统恶性肿瘤。
近年来，随着医疗技术的不断进步，抗白血病药物的研发和应用越来越受到关注。
在这篇文章中，我们将重点介绍一种抗白血病药物，以及它对白血病细胞生长的抑制作用。
一、药物介绍抗白血病药物是一种针对白血病细胞的特异性药物，通过干扰异常细胞的生长、分裂和存活来治疗白血病。
目前，应用较广泛的抗白血病药物包括化疗药物、靶向治疗药物和免疫治疗药物等。
二、白血病细胞生长抑制机制抗白血病药物通过多种机制抑制白血病细胞的生长，主要包括以下几个方面：1. 干扰DNA合成：某些药物能够干扰白血病细胞的DNA合成，阻碍其正常的生长和复制过程。
通过这种方式，药物能有效地抑制白血病细胞的增殖。
2. 阻断信号传导通路：抗白血病药物中的一些靶向治疗药物，通过靶向白血病细胞内特定的信号传导通路，抑制细胞的生长和分裂。
3. 反应性氧化物产生：某些抗白血病药物能够通过诱导白血病细胞产生反应性氧化物，进而导致白血病细胞的死亡。
4. 免疫识别与清除：免疫治疗药物通过增强机体免疫功能，增强对白血病细胞的识别和清除能力，从而抑制其生长和扩散。
三、使用方法1. 用药时间：抗白血病药物的使用时间应根据医生的指导和具体情况来确定。
一般情况下，药物会分为多个疗程，每个疗程包含一段用药时间和一段停药时间。
2. 用药剂量：用药剂量需在医生的指导下确定，剂量的选择会依据患者的年龄、病情和身体状况等因素进行调整。
3. 用药频率：抗白血病药物的用药频率通常为每日一次或每周数次，具体用药频率应根据药物的特性、患者的耐受性和医生的建议来确定。
4. 用药方式：抗白血病药物可以通过口服、静脉注射、皮下注射等方式进行给药，具体方式根据药物的性质和患者的具体情况来确定。
为了达到最佳治疗效果，请在用药期间严格按照医生的处方和用药说明进行用药，并定期进行相关检查以监测疗效和副作用。
胡桃醌通过降低AKT活性抑制肺癌A549细胞增殖
胡桃醌通过降低AKT活性抑制肺癌A549细胞增殖刘元银;雷淑慧;杨燕;蒋幼凡【摘要】目的探讨肽酰脯氨酰顺反异构酶(PIN1)抑制剂胡桃醌(Juglone)对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制.方法用胡桃醌(0、6.25、12.5、25和50μmol/L)处理A549细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡及周期,real-time PCR检测PIN1、AKT mRNA表达,Western blot检测PIN1、AKT 及AKT-pS473蛋白表达.结果胡桃醌能浓度依赖性抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞在G2/M期和S期.与对照组相比,各处理组PIN1 mRNA水平随着胡桃醌浓度增加而降低(P＜0.05).不同浓度胡桃醌处理组PIN1蛋白表达为1.032±0.056、0.892±0.024、0.596±0.023和0.396±0.021,均显著低于对照组的1.280±0.046(P ＜0.05)；AKT-pS473蛋白表达为0.554±0.023、0.464±0.018、0.362±0.015和0.228±0.020,均显著低于对照组的0.626±0.015(P ＜0.05)；48 h处理组PIN1及AKT-pS473蛋白表达分别为0.575±0.036和0.338±0.014,显著低于24h的0.764±0.032和0.436 ±0.023(P ＜0.05).结论 PIN1抑制剂胡桃醌可以抑制肺癌A549细胞的增殖,其机制可能是通过降低AKT-pS473活性来实现的.%Objective To explore the effect and mechanism of PIN1 inhibitor Juglone on cell proliferation of human lung cancer cells A549 in vitro.Methods A549 cells were treated by different concentrations of Juglone.Cell proliferation was measured by MTF assay respectively.The apoptosis rate and cell cycle of A549 cells were detected by flow cytometry.Real-time PCR was carried to detect the mRNA expression of PIN1 and AKT.Western blot were used to observe the protein expression of PIN1 and AKT-pS473 in cells.Results With the increasing ofJuglone's concentration,the inhibition effect on proliferation and the apoptosis rate of A549 cells enhanced in a dose-depended manner,andA549 cells cycle were blocked in G2/M and S period.Real-time PCR result showed the mRNA level of PIN 1 in A 5 4 9 cells treated by Juglone significantly decreased compared with control group.Western blot showed that the protein expression of PIN1 in Juglone groups were 1.032 ±0.056,0.892 ± 0.024,0.596 ± 0.023,0.396 ±0.021,significantly lower than that of control group 1.280 ±0.046 (P ＜0.05).the protein expression of AKT-pS473 in Ju glone groups was 0.554 ±0.023,0.464 ±0.018,0.362±0.015,0.228 ±0.020,significantly lower than control group 0.626 ± 0.015 (P ＜ 0.05).the protein expression of PIN1 and AKT-pS473 in cells treated by Juglone for 48 h were 0.575 ±0.036 and 0.338 ±0.014,signif icantly lower than 0.764 ±0.032 and 0.436 ± 0.023 of 24 h group (P ＜ 0.05).Conclusions Inhibiting the expression of PIN1 with Juglone can significantly depress the proliferation activity of A549 through decreasing the phosphorylation level of AKT.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2013(033)008【总页数】6页(P1032-1037)【关键词】肽酰脯氨酰顺反异构酶;胡桃醌;细胞增殖;肺癌【作者】刘元银;雷淑慧;杨燕;蒋幼凡【作者单位】重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010;铜梁县人民医院重症监护科,重庆402560;攀枝花市中心医院呼吸内科,四川攀枝花617067;重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010【正文语种】中文【中图分类】R734.2肽酰脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PIN1)是目前已知调节磷酸化丝氨酸/苏氨酸基序顺反构象变化唯一的酶［1］，在多种肿瘤组织中都呈现过表达［2］。
胡桃醌诱导细胞凋亡机制的研究进展
第34卷第2期吉林医药学院学报v01．34N o．22叭3年04月Jou玎l al of Ji l i n M edi cal C0ue ge A pr．2013—127一文章编号：1673-2995(2013)02一0127旬3胡桃醌诱导细胞凋亡机制的研究进展T he r es ear ch pr ogr ess on apopt嬲i s i nduce d by J ugl one综述那文婷1，李博雅1，韩景春2，吴亚猛2，杨森1，李洪1，陈飞儿1综述，张巍2+审阅(吉林医药学院：1．临床医学院，2．基础医学院，吉林吉林132013)摘要：恶性肿瘤一直是威胁人类健康的一大主要因素，现如今肿瘤治疗技术日益进步，但开发与研究新型有效的抗肿瘤药物一直是生物医药研究领域的重要任务。
近年来，胡桃楸提取物胡桃醌抗肿瘤的作用机制已不断被现代医学研究所揭示。
胡桃醌主要通过诱导细胞凋亡而发挥出对肿瘤细胞的抗癌活性，在临床肿瘤的治疗中很有望成为预防药物。
本文通过对胡桃醌诱导细胞凋亡的机制、凋亡相关基因p53、＆f一2参与的基因调控、C aspase的活化等凋亡过程中关键步骤的研究进展进行阐述，对将来进一步探究胡桃醌机理的实验研究和临床应用给予理论支持。
关键词：胡桃醌；肿瘤细胞；凋亡中图分类号：R979．1文献标识码：A胡桃醌(j udone，nue i n)是存在于胡桃科胡桃属植物胡桃楸和核桃中的小分子萘醌，又名5一羟基一l，4一奈醌；5一羟基一l，4一奈二酮。
胡桃醌天然存在于胡桃属植物和胡桃皮中，人工提取出来常为橙黄色或红黄色针状结晶，性质不稳定，温度、pH以及光照都可以使其降解。
其熔点为155℃，微溶于热水，易溶于氯仿和苯，溶于乙醇和乙醚。
是胡桃楸中主要的毒性物质。
1胡桃醌诱导细胞凋亡的研究背景细胞凋亡的概念是由澳大利亚科学家John．F．H．K er r等人于1972年首次提出的。
细胞凋亡是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种自主有序的死亡过程。
青龙衣中胡桃醌的药用研究进展
青龙衣中胡桃醌的药用研究进展2.黑龙江大学化学化工与材料学院,哈尔滨150080)摘要：胡桃醌来源于核桃楸提取物，在青龙衣中提取含量最高含量为14.04mg/g。
以超声波辅助常温溶剂萃取效果较好。
所提取的胡桃醌衍生物涉及其烃基、羟基、烃氧基、糖苷基取代以及骨架的还原、并环及低聚等。
胡桃醌具有广谱的抗肿瘤活性，是一种有价值的先导药物。
关键词：胡桃醌; 核桃酮; 1-四氢萘酮; 蒽醌; 抗癌Progressin Medicinal Research of Juglone in Green Walnut HusksDONG Xia[1]1, ZHANG Chen-wei1,PENG Jing1, JIA Hao-nan1, CHEN Zheng-jun2(1.Department of Rheumatology, Heilongjiang Provincial Hospital,Haerbin 150036; 2. School of Chemistry and Materials Science, Heilongjiang University, Haerbin 150080)Abstract: Natural juglone was extracted from juglans mandshurica and the highest juglone content extracted in green walnut husks was 14.04mg/g. Ultrasonic-assisted solvent extraction at room temperature is best among various methods. Natural juglone derivatives consisted of hydrocarbonyl, hydroxyl, alkoxyl, glycosyl as well as carbon skeleton reduction, oligomerization and benzo ring derivants. Juglone derivatives feature broad spectrum antitumor activities. Juglone deserves a privileged prototypes structure for pharmaceutal chemistry to develop new bioactive compounds.Keywords: Juglone;Regiolone;1-Tetralone; Anthraquinone; Anti-tumor核桃楸是一种胡桃科乔木，又名胡桃楸、胡核桃、山核桃等。
胡桃醌对肝癌HepG2细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用_赵行宇
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１３）０２－０２５５－０４ ＤＯＩ：１０．７６９４／ｊｌｄｘｙｘｂ２０１３０２１４［收稿日期］ ２０１２－０９－１２［基金项目］ 吉林省教育厅“十二五”教育技术研究项目资助课题（２００９－３１４，２０１１－２８６，２０１２－３３４）；吉林医药学院大学生科研基金项目资助课题（吉医学科字２０１１－０５）［作者简介］ 赵行宇（１９７０－），男，安徽省五河县人，副教授，医学硕士，主要从事抗肿瘤药物的研究。
［通信作者］ 张 巍（Ｔｅｌ：０４３２－６４５６０４５９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｌｍｍｃｚｗ＠１６３．ｃｏｍ）网络出版时间： ２０１３－０３－０５ １４：１８网络出版地址： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２２．１３４２．Ｒ．２０１３０３０５．１４１８．００１．ｈｔｍｌ胡桃醌对肝癌ＨｅｐＧ２细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用赵行宇，杨 森，周丽霞，那文婷，陆 莉，王译擘，吴 珏，张 巍（吉林医药学院，吉林吉林１３２０１３）［摘 要］ 目的：探讨胡桃醌对肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖的影响，阐明其可能的作用机制。
方法：选取处于对数生长期的肝癌细胞株ＨｅｐＧ２分为空白对照组和不同剂量（４０、８０、１２０、１６０和２００μｍｏｌ·Ｌ－１）胡桃醌组。
采用ＭＴＴ法观察胡桃醌对ＨｅｐＧ２细胞的抑制作用，并计算出半数抑制浓度（ＩＣ５０），依据ＩＣ５０确定胡桃醌的有效浓度；在光学显微镜下观察细胞形态学变化；免疫化学法检测ＨｅｐＧ２细胞中Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白的表达；流式细胞术测定１２０μｍｏｌ·Ｌ－１胡桃醌对ＨｅｐＧ２细胞凋亡周期的影响。
结果：胡桃醌的ＩＣ５０为１３９．８８８ １μｍｏｌ·Ｌ－１。
与空白对照组比较，各剂量胡桃醌组ＨｅｐＧ２细胞增殖抑制率明显升高（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），并呈剂量依赖性。
形态学观察，胡桃醌组细胞体积缩小，连接消失。
加入胡桃醌与敲除胡桃醌的胡桃楸水提物的抗肿瘤活性
加入胡桃醌与敲除胡桃醌的胡桃楸水提物的抗肿瘤活性王添敏;俞文婕;邸学;徐洋洋;张慧;初正云;翟延君【摘要】Objective Juglans mandshurica (JM) extract and juglone,one major compound of JM, both showed anti-tumor activity.This paper was aimed to explore the contribution that juglone made to the anti-tumor activity of JM extract.Methods According to the evaporability of juglone,it was knocked out of JM extract by decocting,and the JM water extract without jouglone was prepared.By adding juglone to the JM decoction,JM water extract with juglone was obtained.The in vivo anti-tumor activity of JM water extract with or without juglone was compared by mice bearing murine-hepatocarcinoma (H22) model.Tumor weight and tumor inhibition ratio were obtained for the evaluation of the anti-tumor activity.Immune organ index and peripheral blood parameters were determined to estimate the protective effects on normal functions of H22 tumor bearing mouse.Results JM water extract with juglone showed anti-tumor activity ina dose-dependent manner,with tumor inhibition ratio of 31.96% and50.61%,at low and high dose,respectively.While the tumor inhibition ratio of JM water extract without juglone at low and high dose was 37.01% and 12.35%,respectively.At high dose,the anti-tumor activity of JM water extract with juglone was statistically stronger than that without juglone.JM water extract with juglone at low dose could rectify the number of red blood cell of mice bearing H22 tumor,and JM water extract without juglone at high dose could adjust the abnormal of the percentage oflymphocyte and neutrophil to normal state.Other JM water extract showed no effect on the immune organs and peripheral bloodparameters.Conclusion JM water extract exhibited potent anti-tumor activity.At high dose, juglone made major contribution to the anti-tumor activity of JM water extract.%目的明确胡桃醌对胡桃楸抗肿瘤作用的贡献.方法将胡桃醌及胡桃楸所有成分作为整体考虑,利用胡桃醌易挥发的性质,通过水煎煮敲除胡桃醌,比较加入和敲除胡桃醌的胡桃楸水提物在小鼠体内的抗肿瘤活性.采用荷H22肝癌小鼠模型,以瘤质量、抑瘤率、免疫器官指数和外周血常规参数评价不同样品的抗肿瘤活性及对荷瘤机体的影响.结果加入胡桃醌的胡桃楸水提物低、高剂量组能显著抑制小鼠H22肝癌细胞的生长,抑瘤率分别为31.96%和50.61%,呈量效关系.敲除胡桃醌的胡桃楸水提物低、高剂量组的抑瘤率分别为37.01%和12.35%,不呈量效关系.胡桃楸水提物中加入胡桃醌高剂量后,抑瘤率显著提高;加入胡桃醌低剂量后能改善荷瘤小鼠红细胞数量的异常;敲除胡桃醌高剂量组能改善荷瘤小鼠淋巴细胞百分比和中性粒细胞百分比的异常;其余各胡桃楸提取物对荷瘤小鼠免疫器官和外周血常规的异常无明显改善作用.结论胡桃楸水提物具有较好的抗肿瘤活性;胡桃醌高剂量组对胡桃楸水提物的抗肿瘤作用贡献较大.【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2017(032)004【总页数】6页(P480-485)【关键词】胡桃楸;胡桃醌;水提物;H22小鼠肝癌;体内抗肿瘤【作者】王添敏;俞文婕;邸学;徐洋洋;张慧;初正云;翟延君【作者单位】辽宁中医药大学药学院,大连 116600;辽宁中医药大学药学院,大连116600;辽宁中医药大学药学院,大连 116600;辽宁中医药大学药学院,大连116600;辽宁中医药大学药学院,大连 116600;辽宁中医药大学药学院,大连116600;辽宁中医药大学药学院,大连 116600【正文语种】中文【中图分类】R965胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)为胡桃科(Juglandaceae)胡桃属植物[1]，作为中药最早记载于《开宝本草》，其青果皮具有补肾固精、敛肺定喘、抑菌镇咳及抗癌的功效，《中药大词典》[2]和《辽宁省中药标准》[3]中均有收载，其具有清热、解毒、明目和抗肿瘤等功效。
胡桃醌抗肿瘤作用及其机制研究
胡桃醌抗肿瘤作用及其机制研究研究背景恶性肿瘤是当前危害人类健康的重要疾病之一,是新世纪人类第一杀手,对人类生存构成最严重的威胁。
目前较为成熟的治疗方法有手术治疗、放射治疗、药物治疗及免疫治疗四类。
近几年来,肿瘤化疗取得了很大的进步,但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗效果不尽人意;并且绝大多数抗肿瘤药物在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时,对正常组织、器官不可避免地产生损害或毒性作用,给患者带来痛苦,甚至导致死亡。
因此,开发与研究新型有效的抗肿瘤药物是生物医药科研领域的重大课题和长期任务。
我国的药用植物物种资源丰富,含抗癌活性成分的物种有200种左右,迄今已通过肿瘤细胞株及动物移植性肿瘤筛选的植物单体成分已超过4000余种。
植物来源药物在化学结构和作用机制方面均具有多样性;同时,长期以来中医治疗肿瘤的研究已积累丰富的资料和经验,有助于开发和研制植物来源的抗肿瘤新药。
因此,从天然药物中获取有效成分并以此为先导化合物是抗肿瘤药物研究和开发的重要途径之一。
胡桃醌(Juglone;Nucin)又名5-羟基-1,4-萘醌;5-羟基-1,4-萘二酮。
是从胡桃楸新鲜根皮、枝皮、青果皮中分离出来的羟基萘醌类化合物,是胡桃楸中主要的毒性物质。
在中国胡桃楸皮作为民间抗癌验方,历史悠久,作为胡桃楸的主要成分胡桃醌的抗癌活性研究也有报道。
近年来有研究显示其具有抗真菌、抗衣原体或抗HIV病毒、抗癌、降血糖和杀虫等生物活性,越来越受到人们的重视。
因此,进一步开发胡桃醌抗肿瘤活性,了解其作用机制,有着非常重要的现实意义。
目的筛选敏感细胞株,探讨胡桃醌抗肿瘤作用的细胞学机制;在体实验考察胡桃醌抗肿瘤活性,并对其毒性进行评价;研究胡桃醌对肿瘤转移形成的影响;检测胡桃醌SD大鼠血浆蛋白结合率,为其机体代谢提供一定理论基础。
方法1.采用MTT法测定胡桃醌对不同细胞株的生长抑制率,筛选敏感细胞株。
2.采用Flou-3/AM法检测胡桃醌对BEL-7402细胞内游离钙离子浓度的影响,通过流式细胞仪观察12.5μmol/L胡桃醌作用后细胞线粒体膜电势的变化、细胞周期分布及凋亡细胞比率,采用荧光偏振技术离体动态地检测30min内胡桃醌对BEL-7402细胞各向异性r、荧光偏振度mP和微粘度η的影响,分析细胞膜流动性的改变。
211181028_天然抑菌剂胡桃醌的抑菌机理初探
第13卷第2期 吕梁学院学报2023年4月Vol.13No.2 Journal of Lyuliang University Apr.2023·基础理论研究·收稿日期:2023⁃03⁃09基金项目:山西省自然科学基金资助项目(20210302123256)第一作者简介:胡青平(1972-),女,山西离石人,教授,研究方向为微生物学.天然抑菌剂胡桃醌的抑菌机理初探胡青平1,吴 婷1,刘 婷2,张亮亮2,徐建国2(1.山西师范大学生命科学学院,山西省太原市030031;2.山西师范大学食品科学学院,山西省太原市030031)摘 要:随着人们对食品安全的日益关注,开发新型天然抑菌剂成为研究热点.胡桃醌作为核桃青皮中的主要天然活性物质,其研究多集中在医学方面,而其对食品腐败菌的抑菌机理研究还未见详细报道.本文以市售胡桃醌为研究对象,选用8种常见食用腐败菌为供试菌株,首先用牛津杯法测定了抑菌圈,用倍比稀释法测定了MIC 和MBC ,结果显示,对胡桃醌高敏感度的是Staphylococcus aureus 和Pseudomonas aeruginosa.其抑菌圈大小分别为26.16±2.49mm ,18.76±0.12mm ,MIC 和MBC 分别均为15mg /mL 和30mg /mL.接着,经流式细胞仪、SEM 、荧光倒置显微镜、SDS -PAGE 和琼脂糖凝胶等试验探究了胡桃醌对S.aureus 和P.aeruginosa 的抑菌机理.结果显示,菌体表面发生褶皱、凹陷,严重者细胞膜通透性增大,导致细菌细胞死亡.另外,胡桃醌对菌体蛋白和核酸等生物大分子也会造成不同程度的影响,也是其抑菌的机制之一.关键词:胡桃醌;抑菌效果,抑菌机理中图分类号:TS202.3 文献标识码:A 文章编号:2095-185X(2023)02-0001-06 胡桃醌(Juglone),一种羟基萘醌类化合物[1],是胡桃属核桃青皮的有效成分之一.早期研究表明,核桃青皮衣味辛、微寒,具有清热、解毒、止痢、明目、抗肿瘤等作用,对泄泻、痢疾、皮炎等疾病有很好疗效[2].国内外研究学者们对胡桃属植物根枝叶进行了较多的研究,而对核桃青皮有效成分研究较少[3].胡桃醌在核桃青皮中含量较高,所以天然胡桃醌的提取曾是热点问题之一[4].随着人们对食品安全和健康问题的普遍关注,天然防腐剂的开发越来越受大家青睐.植物源天然抑菌剂是生物防腐剂的一种,主要出于植物自身保护而产生抑菌作用的物质,或可食用、药用草本等植物中含有许多次级代谢产物[5].这些化合物仍处在研究阶段,还未普及商业化.天然抑菌剂因其抑菌效果良好[6]、更易被人们接受等优势,成为当今研究热点.目前,主要对酚类化合物的研究比较多[5],而对胡桃醌的研究多集中在医学领域,如对牛皮癣等皮肤病[7],对食道癌等疾病[8],抗肿瘤[9],抑制病原菌的生长等[10].另外,偶有作为健康环保、对人体无害天然染发剂的报道[11],也有对抑菌效果的初步评估,但对食品常见腐败菌的抑制机理方面,还未见详细报道.本文主要以市售胡桃醌为研究对象,考查了其对常见食品腐败菌的抑菌效果,并以对其高敏感的S.aureus 和P.aeruginosa 两种菌株作为指示菌,从形态、细胞膜通透性及生物大分子等方面,初步探究胡桃醌的抑菌机理.1 材料与方法1.1 试验菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、白色葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis )、枯草芽孢杆菌(Ba⁃cillus subtilis )、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes )、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa )、伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimuriu )、大肠杆菌(Escherichia coli )、痢疾杆菌(Shigella dysenteriae ),由山西师范大学生1命科学学院微生物实验室提供.1.2 培养基及试剂LB琼脂、LB肉汤培养基均购买于北京奥博星生物技术有限责任公司;胡桃醌(≥97.0%,H136625)购于阿拉丁试剂公司;PI染液购于BD公司;细菌全蛋白提取试剂盒和细菌基因组DNA快速抽提试剂盒购于上海生工生物工程有限公司;其他均为化学纯.1.3 主要仪器与设备LS-50H立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司);QYC-2102C恒温摇床(上海福玛科学仪器有限公司);C5流式细胞仪(BD Biosciences公司);荧光倒置显微镜(徕卡公司).Centrifuge5840R高速冷冻离心机(Gene公司);JY-SCZ2+型双垂直电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司);JY-SPBT水平电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司);Universal Hood II凝胶成像系统(Bio-Rad公司);JEOLJSM-7500扫描电子显微镜(日本岛津公司).1.4 试验方法1.4.1 抑菌圈的测定将菌种活化接种到已灭菌的LB培养基中,37℃培养培养至对数期,用无菌水调整稀释至107CFU/mL,备用.牛津杯法测定胡桃醌的抑菌圈大小[12].取200μL菌悬液,均匀涂布平板,轻轻放落牛津杯,分别加入100μL 无水乙醇(对照)和胡桃醌溶液(4mg/mL),至37℃的培养箱培养24h.测量抑菌圈的大小,每组三次重复. 1.4.2 最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)的测定采用倍比稀释法[13],取6个试管,分别加入50μL107CFU/mL菌液和5mL无菌肉汤培养基,再加入不同浓度的胡桃醌溶液,使其胡桃醌的终浓度分别为320μg/mL,160μg/mL,80μg/mL,40μg/mL,20μg/mL, 10μg/mL.37℃,120rpm,恒温摇床培养箱24h,观察依旧澄清的最低浓度则为胡桃醌对该菌的MIC.同理,待连续培养第二个24h,澄清的则为MBC.1.4.3 细菌细胞致死率的测定用无菌磷酸缓冲液(PBS)重悬S.aureus和P.aeruginosa细菌细胞,加入胡桃醌,使其终浓度分别为0.5 MIC、MIC、2MIC和空白组.37℃下分别悬浮1h,2h和3h.依次用PBS缓冲液和无菌水混洗,调整菌体浓度至106-107CFU/mL.取0.5mL菌液于4500rpm下离心10min,去上清,加0.5mL荧光染色剂PI/RNase Staining Buffer,避光保存15min,离弃上清,双蒸水清洗,再次重悬后用流式细胞仪检测.1.4.4 SEM观察细菌形态分别经1MIC和2MIC的胡桃醌溶液处理2h后,4℃,5000g离心6min.PBS洗三次,加入2.5%的戊二醛固定,用梯度乙醇依次脱水,离心.取沉淀的菌体加入少许醋酸异戊酯,将液体混匀后用小计量移液枪沾取菌液,滴在特定的专用金属上,晾干喷金,扫描电镜观察[14].1.4.5 细菌细胞膜通透性检测分别取3只盛有109CFU/mL菌体的离心管,加入胡桃醌使其浓度分别为0,MIC,2MIC,置于摇床培养箱中培养1h和2h备用.分别取150μL菌液,经5000g离心,PBS清洗2次后,加入100μL PI荧光染液,避光15min.离心取菌体后用PBS重悬至100μL,荧光显微镜观察并拍照[15].1.4.6 细菌蛋白SDS-PAGE电泳如前所述,分别准备胡桃醌终浓度为0,0.5MIC,1MIC,2MIC,4MIC的菌液,振荡培养2h,离心后弃上清,磷酸缓冲液清洗.按细菌蛋白提取试剂盒步骤提取细菌蛋白,进行SDS-PAGE.12%分离胶,5%浓缩胶.开始电压80V,进入分离胶后调至120V,染色40min后脱色,置于凝胶成像系统中进行拍照.1.4.7 细菌DNA及其凝胶阻滞分析如前所述,分别准备胡桃醌终浓度为1/2MIC,1MIC,2MIC,4MIC的菌液,振荡培养2h,离心后收集菌体.按试剂盒提取DNA,进行琼脂凝胶电泳.提取好的细菌DNA悬浮于PBS,加入胡桃醌溶液使其最终浓度为0.5MIC、MIC、2MIC、4MIC,然后水浴锅中预热半小时,进行琼脂凝胶电泳[14].1.4.8 数据统计用SPSS17.0进行数据分析,用LSD方法分析各抑菌圈之间的显著性(p<0.05),重复3次.22 结果与分析2.1 胡桃醌的抑菌效果实验选取了8种常见的食品腐败菌为测试菌株,分别测定了胡桃醌对其的抑菌圈、MIC和MBC等指标,结果见表1.表1 胡桃醌对8种菌的抑菌效果Microorganisms抑菌圈直径/mm MIC/(mg·mL-1)MBC/(mg·mL-1) Gram⁃positive S.aureus26.16±2.49c1530 S.albus23.86±1.41c1530 B.subtilis25.50±2.21c1515 L.monocytogenes23.36±1.40c1515Gram⁃negative S.typhi17.44±1.23b3060 P.aeruginosa18.76±0.12ab1530 S.dysenteriae17.93±0.96b3030 E.coli13.10±1.35a6060 注:小写字母表示各抑菌圈之间差异显著性p<0.05).由表1可见,胡桃醌对革兰氏阳性细菌的抑菌效果明显大于阴性(p<0.05),对阳性菌中抑菌圈最大是S.aureus,抑菌圈达为26.16±2.49mm(大于20mm),对阴性菌抑菌圈最大的是P.aeruginosa,为18.76±0.12 mm(15-20mm).根据牛津杯抑菌圈大小的敏感标准[16],S.aureus对胡桃醌为极敏感菌株,而P.aeruginosa 则为高敏感菌株.MIC和MBC的值越小,说明对该菌的抑菌效果越好.从表1还可以看出,胡桃醌对革兰氏阳性菌株的MIC都一样,均为15μg/mL,而MBC的结果则稍有不同.对阴性菌而言,各菌的MIC和MBC都不同.综合考虑抑菌圈、MIC和MBC等结果,将选择胡桃醌对其抑菌能力相对强的阳性菌S.aureus和阴性菌P.aeruginosa作为进一步的抑菌机理研究.2.2 胡桃醌对细菌死活率的影响1.用流式细胞仪分别对经胡桃醌处理后的S.aureus和P.aeruginosa的活细胞进行了检测,结果见图图1 金黄色葡萄球菌(a-c)和铜绿假单胞菌(d-f)的流式细胞仪分析注:图中黑色表示未加胡桃醌,绿和红色分别表示MIC,2MIC的处理组,a-c和d-f分别表示S.aureus和P.aeruginosa培养1h,2h和3h.3各峰中轴线在横轴和纵轴上的位移越大,说明菌体的死亡率越大.从图1可知,与对照相比,加入胡桃醌处理(绿色和红色)后的组的中轴线均有向右移的趋势,部分处理还有在纵轴方向向上移的趋势.在培养1h 时,2MIC的死亡率最大,而MIC处理组的峰中轴移动不明显(见图1-a和1-d).随着培养时间段延长,绿色峰中轴向右移动,到3h时,基本和红色峰中轴处于同一位置,说明浓度越大时间越长,胡桃醌对菌的致死率越大.从而可以看出,图1-c的红色峰中轴的纵向位移大于图1-f的,说明胡桃醌对S.aureus的致死率大于对P.aeruginosa的.2.3 胡桃醌对食品腐败菌形态的影响对胡桃醌处理后的S.aureus a和P.aeruginosa进行了扫描电镜观察,结果见图2.从图2可以看出,经不同浓度胡桃醌处理后,S.aureus个体间出现聚集现象,且表面有明显褶皱(图2-b,2-c).而P.aeruginosa,细胞形态变化明显,除有皱褶外,在高浓度作用下细胞还出现了破裂(图2-e,2-f).图2 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的扫描电镜结果注:a,d为空白;b,e为MIC胡桃醌处理组;c,f为2MIC胡桃醌处理组2.4 胡桃醌对细菌细胞膜通透性的影响PI作为一种荧光染料可以与DNA相结合,使其染色.当细胞膜活性被破坏后染料即可进入细胞嵌合在DNA上,经发光源激发后会呈现红色的荧光.从图3可以看出,未经胡桃醌处理的对照组中未见有红色荧光点出现(图3-Aa,Ad,Bg,Bj).图3-Ae是经MIC处理S.aureus2h的,其红色荧光点明显多于图3-Ab (MIC处理S.aureus1h),同样的结果也出现在胡桃醌对P.aeruginosa的作用(图3-Bh,Bk).2MIC的胡桃醌作用后,红色荧光点更多(图3-Ac>Ab,Bi>Bh).这些结果说明胡桃醌的浓度越大,作用时间越长,红色荧光点越多,细菌细胞膜的通透性就越大.但是,在2h甚至更长的时间处理后,高浓度的胡桃醌作用反而会时荧光强度减弱(图3-Ac,Af),究其原因也可能是高浓度的胡桃醌会对S.aureus的细胞膜破坏较大,使其中的核酸产生泄露使得荧光亮度反而减少.2.5 胡桃醌对细菌蛋白量的影响经不同浓度的胡桃醌处理后,分别对两种菌体的蛋白进行SDS-PAGE,结果见图4.从图4-A可以看出,胡桃醌对金葡蛋白含量和组分的影响不大,只有用4MIC高浓度处理1h,才表现出蛋白条带的弱化和丢失现象.而在图4-B中,则相反,与对照相比,随着胡桃醌浓度的增加,P.aeruginosa的蛋白条带会增强,说明胡桃醌有可能诱导了蛋白的合成.总之,胡桃醌可以影响两个菌体蛋白的生物合成量.2.6 胡桃醌对细菌DNA的影响胡桃醌对两种菌体DNA的影响见图5.随着胡桃醌浓度的增加,细菌DNA条带的清晰度逐渐减弱,到第6泳道,几乎检测不到DNA了.且对两种菌DNA的影响是相似的.电泳结果初步说明胡桃醌进入菌体细胞后,可能引起了两个细菌核酸的降解.为了说明胡桃醌是否与细菌DNA进行了直接结合,我们进行了细菌DNA的凝胶阻滞电泳试验,结果见图6.从图6可以看出,与空白相比(泳道1),随着胡桃醌浓度的不断增加,两种细菌的DNA条带无论从亮度4图3 金黄色葡萄球菌(A )和铜绿假单胞菌(B )荧光显微观察注:a,,d,g,j 为空白;b,e,h,k 为MIC,1h;c,f,i,l 为2MIC,2h图4 金黄色葡萄球菌(A )和铜绿假单胞菌(B )的蛋白电泳图注:泳道1为对照;泳道2-6分别为经0.25、0.5、1、2和4MIC 的胡桃醌处理1h.还是浓度上都没有显著变化,DNA 分子量几乎不变,说明体外胡桃醌对两菌体DNA 的影响不明显,胡桃醌并未与这两种菌体的DNA 直接发生作用.3 讨论与结论胡桃醌作为核桃青皮有效活性成分之一,早在中东地区就有记载核桃青皮有药用价值.我国医学药学中也有记载核桃青皮可以治疗真菌性皮肤病.何开泽等的研究说明核桃青皮提取物可以抑制金葡等四种微生物的生长[17].本文在前人的基础上,扩大了指示菌范围,并借用了多种抑菌效果的检测指标,测定了胡桃醌对8种指示菌的抑菌效果,并初步判断了其对不同菌种的敏感性.有学者研究了丁香酚对B.subtilis 的MIC 为312.5mg /mL,苯乳酸对B.subtilis 的MIC 为500mg /mL [18].结合我们的MIC 和MBC 结果(15mg /mL),相比其它天然抑菌剂的MIC 要小很多,充分验证了胡桃醌的抑菌能力较强,极具有天然抑菌剂的开发潜力.但如果作为天然防腐剂应用于延长食品的存储时间,仍还需一段距离.细菌细胞膜的完整性不仅对抵御外界不良环境起着重要作用,而且对细菌本身的生长繁殖也非常重要,若破损严重亦可导致细胞死亡.本文通过SEM 形态和PI 荧光染色试验,揭示了胡桃醌对细菌细胞膜造成了一定程度的破坏,增加了细胞膜的通透性,且浓度越高,作用时间越长,对细菌细胞膜的损伤越严重.5图5 金黄色葡萄球菌(A)和铜绿假单胞菌(B)的DNA电泳注:泳道1为对照;泳道2-6分别为经0.25、0.5、1、2和4MIC的胡桃醌处理1h.图6 胡桃醌对金黄色葡萄球菌(A)和铜绿假单胞菌(B)DNA的凝胶阻滞分析注:泳道1为对照;泳道2-6分别为经0.25、0.5、1、2和4MIC的胡桃醌处理1h.为阐明胡桃醌进入细菌细胞后,对生物大分子将发生怎样的影响,本文进行了SDS-PAGE分析,结果显示,胡桃醌对两个菌的蛋白含量都有不同程度的影响,但作用方式则完全不同,高浓度的胡桃醌可以引起S.aureus蛋白的降解,而能诱导P.aeruginosa蛋白的合成(图4).通过DNA的琼脂糖凝胶电泳,同样证明了胡桃醌对两种细菌的DNA都有相似的影响,即高浓度的胡桃醌可以引起菌体DNA发生降解或消失(图5),但进一步的体外凝胶阻滞试验则表明,经不同浓度胡桃醌作用后,细菌的DNA含量几乎没有发生变化,充分证明了胡桃醌并没有喝细菌的DNA直接结合,然而胡桃醌对菌体DNA的作用机制还需进一步研究和探索.综上,胡桃醌具有广谱抑菌活性,是一种极具开发潜力的天然抑菌剂.其可能是通过损伤细菌细胞膜,增加膜通透性,进而引起细胞内容物泄露,细菌形态严重变形,同时,引起细菌内核酸和蛋白质等生物大分子的降解或影响其生物合成方向,阻碍了细菌细胞的正常生长和繁殖,最终导致S.aureus和P.aeruginosa细胞死亡的.参考文献:[1]李钧,曲中原,邹翔,等.青龙衣中胡桃醌的分离与鉴定[J].哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2011(5).[2]梁勤安,杨军,孙颖,等.核桃青皮剥离过程中影响青皮剥净率和核桃破碎率的因素分析[J].农业工程学报,2004(5).[3]李淑芳,孙光春,鲍淑娟,等.核桃皮酊剂毒性试验研究[J].贵阳医学院学报,1997(4).[4]曲中原,邹翔,管小玉,等.青龙衣不同萃取部位化学成分GC-MS分析[J].中草药,2010(10).[5]Li X,Jiang B,Pan B.Purification and Partial Characterization of Lactobacillus Species SK007Lactate Dehydrogenase(LDH)Cata⁃lyzing Phenylpyruvic Acid(PPA)Conversion into 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胡桃醌地研究进展
胡桃醌的研究进展陆婉1，2 ，曲中原1，2，邹翔1，2，严琴琴1，2,季宇彬1，2(1. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076)摘要：胡桃醌为胡桃科核桃属植物胡桃楸（Jugland mandshurica Maxim）和核桃（Juglans regia L）中存在的重要活性物质，具有抗肿瘤、抗炎和抑菌等药理作用。
随着化学分析技术的不断提高和分子生物学技术在药理中的应用，胡桃醌的化学和药理研究取得了一定进展。
本文对胡桃醌近年来国内外的研究成果进行综述。
关键词：胡桃醌药理作用抗肿瘤作用Advances Research of JugloneLU Wan1，2, QU Zhong-yuan1，2,ZOU Xiang1，2,Yan Qin-qin1，2, JI Yu-bin1，2(1.Engineering Research Center of natural antineoplastic drugs，Ministry of Education; 2.Centerof Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, HarbinUniversity of Commerce, Harbin 150076)ABSTRACT: Juglone for Juglandaceae walnut plant nuts chinense (Jugland mandshurica Maxim) and walnut (Juglans regia L) in the important substances with anti-tumor and anti-inflammatory and antibacterial, and other pharmacological effects. With the chemical analysis of the continuous improvement of technology and molecular biology technology in the application of pharmacology, the chemical and pharmacological research of Juglone has made some progress.This paper reviews domestic and international research results of Juglone in recent years.KEY WORDS :Juglone; pharmacological action ; antitumor effect胡桃醌（Juglone）属于萘醌类成分，存在于胡桃科核桃属植物胡桃楸（Jugland mandshurica Maxim）和核桃（Juglans regia L）的根皮、树皮、青果皮（青龙衣）、叶中[1]，具有明确的抗肿瘤作用，此外，还具有抗菌、抗炎等药理作用，因此，越来越受到人们的重视。
胡桃醌对宫颈癌细胞增殖的抑制作用及其机制
胡桃醌对宫颈癌细胞增殖的抑制作用及其机制赵行宇;杨欣;朱志华;何涵;宋梓桐;张巍【期刊名称】《吉林大学学报:医学版》【年(卷),期】2022(48)2【摘要】目的:比较胡桃醌对人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌Caski细胞、HPV阴性C33A细胞和敲减脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)基因的Caski细胞(shCaski细胞)增殖的抑制作用,探讨其可能的作用机制。
方法:构建表达Pin1 shRNA慢病毒载体用于感染细胞,筛选得到稳定的shCaski细胞。
取对数生长期的Caski、shCaski和C33A细胞,分为正常对照组、10、20、50和100μmol·L^(-1)胡桃醌组,胡桃醌处理24 h后,采用MTT法检测各组的细胞增殖活性。
取对数生长期的Caski细胞和C33A细胞,分为对照组和20μmol·L^(-1)胡桃醌组,各组细胞处理24 h后,流式细胞术检测各组不同周期细胞百分率和早期凋亡率,Hoechst33258荧光染色观察各组细胞形态表现,Western blotting法检测各组细胞周期和凋亡相关蛋白表达水平。
结果:MTT实验,与正常对照组比较,不同浓度胡桃醌组Caski细胞增殖活性明显降低(P<0.05或P<0.01);50和100μmol·L^(-1)胡桃醌组C33A和shCaski细胞增殖活性明显降低(P<0.05)。
Hoechst 33258染色,与对照组比较,20μmol·L^(-1)胡桃醌组Caski细胞和C33A细胞中均可观察到核碎解增加,Caski细胞核碎解数量较C33A细胞多。
流式细胞术检测,与对照组比较,20μmol·L^(-1)胡桃醌组Caski细胞G2期细胞百分率明显升高(P<0.01),20μmol·L^(-1)胡桃醌组C33A细胞G2期细胞百分率差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,20μmol·L^(-1)胡桃醌组Caski细胞早期凋亡率明显升高(P<0.01),20μmol·L^(-1)胡桃醌组C33A细胞早期凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);Western blotting法检测,与C33A细胞比较,Caski细胞中Pin1蛋白表达量明显升高;胡桃醌组Caski细胞和shCaski细胞中Pin1蛋白表达量明显低于对照组;与对照组比较,胡桃醌组C33A细胞中细胞周期相关蛋白表达水平明显改变;Caski细胞中磷酸化ATM(Patm)、磷酸化细胞周期检查点激酶2(pChk2)、216位丝氨酸磷酸化细胞分裂周期蛋白25c(pCdc25c Ser216)和pCdc25c Tyr216蛋白表达量升高,磷酸化细胞分裂周期蛋白25c(pCdc25c)蛋白表达量降低,Cdk1蛋白表达量变化不明显;与对照组比较,胡桃醌处理组Caski细胞中Bcl-2蛋白和线粒体CytC蛋白表达量降低,胞质CytC、Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白表达量升高。
胡桃属植物防治肿瘤研究进展_芦柏震
收稿日期:2009-11-21作者简介:芦柏震(1956-),男,浙江嘉兴人,主任中药师,研究方向:医院中药学。
使肠线浮入穴内,不能露出皮外,出针后用干棉球压迫穴位1~2m i n ,防止出血。
围浮线疗法操作完成后马上配合手法治疗,揉按、提拿股四头肌远端,双手搓、挤压膝关节内外侧;屈膝90b ,拔伸膝关节1~2m i n ;点按内外膝眼、鹤顶;推移、提拿髌骨5~10次,增加髌骨活动范围;伸屈膝关节,于最大限度时停留10s ;提拿、揉按下肢后侧肌肉;膝关节周围手法操作大约15m i n 。
围浮线疗法配合手法治疗1周1次,3次为1个疗程。
本研究采用浮线刺激穴位,作用部位主要是穴位所处的皮下疏松结缔组织层,不进入肌肉,埋线以中医理论为基础,治疗时强调/得气0,但是浮线却不依据中医的传统理论,操作时也不需要/得气0,如果/得气0疗效反而不好,浮线疗法不依据经络和穴位,且不在病痛局部进针。
运用得到浮线配合推拿对于慢性膝骨关节炎效果尤其好。
6 关节腔冲洗及穴位外敷理疗治疗膝骨关节炎伴滑膜炎对于伴有红肿热痛的滑膜炎,老师常常运用的药物曲安钠德0.1mL 加生理盐水30mL 关节腔反复冲洗。
冲洗后常常运用教授的消肿镇痛膏穴位外敷,外加弹力绷带加压包扎,同时制动,以减少运动对滑膜的刺激。
第2天进行穴位超激光进行治疗。
关节腔抽液冲洗可以减少滑膜炎性渗出及加速渗出液的吸收有较强的消炎、镇痛消肿镇痛膏由本医院制剂室配制,具有消肿、散瘀、止痛的作用,通过激光疗法照射,可使局部组织血液循环改善,从而增加组织营养及代谢过程,利于炎症的消除及渗出物的吸收。
老师认为这种方法一是主要适用于关节积液较多的病例;二是激素的运用一定要低浓度;三是穿刺时应严格无菌操作,以防止并发感染;四是消肿镇痛膏及激光的运用要在穴位处进行[5]。
参考文献[1] 徐斌.刺络放血疗法的血管生物学基础[J].中国临床康复,2004,8(24):5126-5127.[2] 穆祥,段惠琴,陈武,等.腧穴实质与微血管相关的生理学研究[J].中国中医基础医学杂志,2001,7(12):47-52.[3] 戴七一.120例膝骨关节病X 线影像分析及手法治疗[J].中国中医骨伤科杂志,2003,11(4):25-27.[4] S alt er RB .The b iol olgy con cep t of CP M of s ynovial joi n t s [J].C lin O r-t hop ,1989,242(1):12225.[5] 童培建,何帮剑,金红婷,等.自拟外洗方结合穴位敷贴治疗膝关节骨性关节炎疗效观察[J].中华中医药学刊,2009,27(1):22-23.专家论坛中华中医药学刊胡桃属植物防治肿瘤研究进展芦柏震,王春雷,侯桂兰,陈小娟(浙江省肿瘤医院,浙江杭州310002)摘 要:胡桃科植物中的胡桃属植物含有醌类、黄酮类、萜类、没食子酸等多种活性成分。
胡桃醌通过促进c-Myc泛素化降解抑制宫颈癌细胞的生长和促进凋亡
Juglone induces proliferation inhibition and apoptosis of cervical cancer cells via promoting c-Myc ubiquitinationZHAO Xingyu 1,YANG Kun 1,SONG Zitong 1,HE Han 2,ZHANG Wei 11Department of Biochemistry,Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2Department of Biochemistry,School of Basic Medicine,Yanbian University,Yanbian 133000,China摘要：目的观察c-Myc 蛋白在宫颈癌HeLa 细胞中的表达，探讨胡桃醌通过影响c-Myc 蛋白泛素化降解进而影响HeLa 细胞的增殖与凋亡。
方法培养人宫颈癌HeLa 细胞，分为对照组：正常培养；10、20、50μmol/L 胡桃醌组：培养液中分别加入对应浓度的胡桃醌。
以Western blot 方法分析胡桃醌处理后c-Myc 蛋白的表达。
HeLa 细胞分为对照组和20μmol/L 胡桃醌组，在培养0、2、4、8h 分别用Western blot 检测c-Myc 蛋白表达的变化；放线菌酮（CHX ）法检测c-Myc 蛋白半衰期的变化；CoIP 方法检测c-Myc 蛋白降解影响。
HeLa 细胞分为空白对照组：正常培养；胡桃醌组：20μmol/L 胡桃醌培养液培养；0.5、1.0、2.0μmol/L MG132组：分别与0、1.0、2.0μmol/L 蛋白酶体抑制剂MG132加20μmol/L 胡桃醌培养，检测c-Myc 蛋白表达的水平。
将si c-Myc 转染入HeLa 细胞后，将细胞分siNC 组：空载体组；si-NC ；胡桃醌组：空载体加20μmol/L 胡桃醌处理；si-cMyc 组：转染Myc RNA ；si-cMyc20μmol/L 胡桃醌组：转染Myc RNA 加20μmol/L 胡桃醌处理。
胡桃醌结构类型属于( )
胡桃醌是一种具有抗菌、消炎、抗肿瘤等生物活性的化合物，其结构类型属于邻苯二酚类化合物。
具体来说，胡桃醌是由两个苯环通过两个氧原子连接而成的，其中一个苯环上的对位碳原子上连接有一个羟基，而另一个苯环上的邻位碳原子上连接有两个羟基。
这种结构类型使得胡桃醌具有较好的水溶性和稳定性，同时也为其在生物体内的活性表现奠定了基础。
除了基本的结构特点外，胡桃醌还具有一些其他的化学和生物学特性。
例如，它是一种天然的抗氧化剂，可以有效地清除体内的自由基，保护细胞免受氧化损伤。
此外，胡桃醌还具有明显的抗炎作用，可以抑制炎症反应的发生和发展，对于一些炎症性疾病的治疗具有一定的疗效。
此外，胡桃醌还可以抑制肿瘤细胞的生长和扩散，对于肿瘤的治疗具有一定的辅助作用。
胡桃醌主要存在于核桃、山核桃等坚果中，是一种天然的活性成分。
除了在坚果中提取外，也可以通过化学合成的方法制备胡桃醌。
此外，近年来也有一些研究表明，胡桃醌可以通过药理学方法进行人工合成，并应用于药物开发和研究中。
总之，胡桃醌是一种具有重要生物活性的化合物，其结构类型属于邻苯二酚类化合物。
它具有抗菌、消炎、抗肿瘤等生物活性，对于一些疾病的治疗具有一定的辅助作用。
同时，胡桃醌也是一种天然的抗氧化剂和抗炎剂，可以有效地保护细胞免受氧化损伤和炎症损伤。
未来对于胡桃醌的研究和应用仍需要进一步深入探讨和研究。
青龙衣中胡桃醌的研究进展
青龙衣中胡桃醌的研究进展温文兵;刘淑萍【摘要】胡桃醌是一种具有很高活性的化学物质,它对肿瘤细胞有一定的抑制作用,对某些植物有毒性作用.目前针对该活性物质的研究成为国内外的研究热点.在核桃楸植物中,与树皮、树叶、花等组织相比,青龙衣中含量较高,许多学者都在研究从青龙衣中提取分离高纯胡桃醌的方法.文章综述了胡桃醌的稳定性、医学研究、生物活性研究、化学成分、纯化方法及检测方法,并指出了该物质以后的研究重点.【期刊名称】《河北联合大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(033)001【总页数】4页(P141-144)【关键词】胡桃醌;抗肿瘤;青龙衣;萘醌【作者】温文兵;刘淑萍【作者单位】河北理工大学化工与生物技术学院,河北,唐山,063009;河北理工大学化工与生物技术学院,河北,唐山,063009【正文语种】中文【中图分类】Q9460 引言核桃青皮，中药称为青龙衣，是胡桃科植物胡桃楸的外果皮。
其中含有含量较高的活性物质胡桃醌（5-羟基-1，4-萘醌）。
青龙衣与其他组织相比具有以下特点：1）青皮脱落后，其中的活性成分胡桃醌会抑制其他作物的生长，甚至杀死其他作物。
2）核桃青皮中的含量较树皮、叶中的含量高。
孙墨珑[1]采用超声波法提取核桃楸中的胡桃醌，结果显示，各组织中的含量为：树皮中为0.131mg/g，青皮中0.229mg/g，叶中0.209 mg/g。
3）青龙衣原料廉价，很多数地区为废弃物，充分利用其中的活性物质，可以有效地利用资源。
1 胡桃醌的稳定性研究季宇彬等考察了不同干燥方法对青龙衣中胡桃醌的含量的影响，结果表明，温度越高，胡桃醌的含量越低，因此采用适当的烘干方法对胡桃醌的提取有重要的影响。
同时，作者也考察了储存时间、采摘时期对提取的影响。
结果表明，储藏时间越长，胡桃醌的含量越低，最佳采摘时间为八月份[2]。
索绪斌等采用索式提取法提取核桃青皮中的胡桃醌，HPLC法检测含量，结果显示贮存年限对胡桃醌含量有很大的影响[3]。
胡桃醌体内抗肿瘤作用研究
胡桃醌体内抗肿瘤作用研究崔兰 1，2，曲中原1，2，邹翔1，2，胡国军1，2，季宇彬1，2(1. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076；2. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076)摘要目的研究胡桃醌的体内抗肿瘤作用。
方法建立S180肉瘤模型，考察胡桃醌对S180荷瘤小鼠的抑瘤率和胸腺指数、脾脏指数的影响；HE染色，观察S180肉瘤的病理改变；建立H22肝癌腹水瘤模型，考察胡桃醌对H22荷瘤小鼠生命延长率的影响。
结果在0.25 mg·kg-1·d-1、0.5 mg·kg-1·d-1、1 mg·kg-1·d-1剂量下，胡桃醌对S180实体瘤的抑瘤率分别为17.09%、22.12%、29.61%，尤其是0.5 mg·kg-1·d-1剂量和1.0 mg·kg-1·d-1剂量抑瘤作用明显（P<0.01）；0.5 mg·kg-1·d-1、1.0 mg·kg-1·d-1剂量的胡桃醌使脾脏指数降低(P<0.05,P<0.01)，各剂量的胡桃醌胸腺指数无明显变化(P>0.05)；光镜下胡桃醌各组肿瘤组织坏死程度明显增加。
在0.25 mg·kg-1·d-1、0.5 mg·kg-1·d-1、1 mg·kg-1·d-1剂量下，胡桃醌对H22荷瘤小鼠的生命延长率分别为73.88%、82.09%、99.25%，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
结论胡桃醌体内有明显的抗肿瘤作用，能有效抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生命。
关键词胡桃醌；抗肿瘤作用；S180；H22Study on the anti-tumor effects of Juglonein vivoCUI Lan1，2, QU Zhong-yuan1，2, ZOU Xiang1，2 , HU Guo-jun1，2, JI Yu-bin1，2(1. Engineering Research Center of natural antineoplastic drugs，Ministry of Education, Harbin 150076, China;2.Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University ofCommerce, Harbin 150076, China)ABSTRACT Objective In this experiment, the anti-tumor effects of Juglone was studied on tumor mice. Methods The graft mouse tumor model S180was used to investigate the effects of juglone on tumor growth and the weights of immune organs. After HE staining, the growth and patho-morphologic changes of tumor cells were observed by optical microscope. The graft mouse tumor model H22was used to investigate the effects of juglone on survival time. Results The inhibitory rate of juglone at the dosage of 0.25, 0.5 and 1 mg·kg-1·d-1was 17.09%, 22.12%, 29.61% respectively. The inhibitory rate of juglone at the dosage of 0.5, 1 mg·kg-1·d-1was significantly increased compared with the control group (P<0.01).Spleen index in 0.5, 1 mg·kg-1·d-1dosage group had significant decrease (P<0.05, P<0.01), and Thymus index had no change. Under the optical microscope, the degree of cell necrosis of juglone group increased significantly compared with the control group. The life prolongation rate of juglone at the dosage of 0.25, 0.5 and 1 mg·kg-1·d-1 was 73.88%, 82.09%, 99.25% respectively, which was significantly increased compared with the control group(P<0.05).Conclusion Juglone has conspicuous anti-tumor effects in vivo. Juglone can inhibite the growth of sarcoma grafts of S180mice and基金项目：国家自然科学基金项目(30600816)；高等学校博士点学科点专项科研基金（20060240001）. 作者简介：崔兰(1982-), 女, 硕士, 研究方向：抗肿瘤药物研究.E-mail:llxxcl@; Tel/Fax：(0451)84866922prolong the life time of H22 mice effectively.KEY WORDS: Juglone; anti-tumor effects; S180; H22胡桃醌(Juglone)是萘醌类成分（5-羟基-1,4-萘醌），天然存在于胡桃属植物中，具有抗菌、抗肿瘤、治疗皮肤病等多种作用[1－3]。
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［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４８６－０４［收稿日期］ ２０１１－１０－１０［基金项目］ 吉林省中医药管理局科研基金资助课题（２０１０－ｔｔ０５６）［作者简介］ 万志强（１９８４－），男，江西省鹰潭市人，在读医学硕士，主要从事白血病和肿瘤诊治的研究。
［通信作者］ 李 薇（Ｔｅｌ：０４３１－８８７８２１８０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｒｗｅｉｌｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）胡桃醌对白血病细胞增殖的抑制作用万志强，李 薇，崔久嵬，徐效益，孙景娟，刘 军（吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林长春１３００２１）［摘 要］ 目的：探讨胡桃醌对白血病细胞增殖的抑制作用，阐明胡桃醌抗白血病的机制。
方法：体外培养人白血病Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ９３７、Ｕ２６６及ＮＢ４细胞株，按不同处理因素分组：调零组，含有培养基、ＭＴＴ和三联溶解液；空白对照组，含有各种人白血病细胞、药物溶解介质、培养液、ＭＴＴ和三联溶解液；实验组，分别采用不同浓度（终浓度为０．２５、０．５０、１．００、２．００、４．００、６．００、８．００和１６．００ｍｇ·Ｌ－１）的胡桃醌作用各种细胞株。
ＭＴＴ比色法检测胡桃醌对白血病细胞的增殖抑制作用。
流式细胞术测定不同浓度胡桃醌对Ｋ５６２细胞株凋亡的影响。
结果：胡桃醌对白血病Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ９３７、Ｕ２６６及ＮＢ４细胞株增殖均有较强的抑制作用，其半数抑制浓度（ＩＣ５０）（４８ｈ）分别为３．８７、１．１３、４．４８、１．８７和４．６７ｍｇ·Ｌ－１。
其中胡桃醌对Ｊｕｒｋａｔ和Ｕ２６６细胞的抑制效果最为明显（Ｐ＜０．０５），胡桃醌对其他３个白血病细胞株的ＩＣ５０值均＜４０ｍｇ·Ｌ－１，且胡桃醌对这５种细胞株增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性。
流式细胞术检测显示，胡桃醌可诱导Ｋ５６２细胞凋亡，１、２、４、８和１６ｍｇ·Ｌ－１胡桃醌作用６ｈ，Ｋ５６２细胞凋亡率分别为（４．５４±０．６）％、（１１．５ ４±０．６）％、（２８．７±０．３）％、（４５．０±１．２）％和（７６．１±１．４）％。
结论：胡桃醌可抑制多种白血病细胞株增殖，其机制可能与促进白血病细胞凋亡相关。
［关键词］ 白血病细胞；细胞凋亡；胡桃醌；ＭＴＴ法；流式细胞术［中图分类号］ Ｒ７３３．７ ［文献标志码］ ＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓＷＡＮ Ｚｈｉ－ｑｉａｎｇ，ＬＩ Ｗｅｉ，ＣＵＩ Ｊｉｕ－ｗｅｉ，ＸＵ Ｘｉａｏ－ｙｉ，ＳＵＮ Ｊｉｎｇ－ｊｕａｎ，ＬＩＵ Ｊｕｎ（Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｏｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉ－ｌｅｕｋｅｍｉａ ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ Ｋ５６２，Ｊｕｒｋａｔ，Ｕ９３７，Ｕ２６６ａｎｄ ＮＢ４ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ｇｒｏｕｐｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｚｅｒｏ ｇｒｏｕｐ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ，ＭＴＴ ａｎｄｔｒｉｐｌｅ ｌｙｓａｔｅ；ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ，ｄｒｕｇ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ，ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ，ＭＴＴ ａｎｄ ｔｒｉｐｌｅ ｌｙｓａｔｅ；ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：０．２５，０．５０，１．００，２．００，４．００，６．００，８．００，１６．００ｍｇ·Ｌ－１）ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ ｄｉｓｐｏｓａｌ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｋ５６２ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｊｕｇｌｏｎｅ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｋ５６２，Ｊｕｒｋａｔ，Ｕ９３７，Ｕ２６６ａｎｄ ＮＢ４ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅｉｒ ＩＣ５０（４８ｈ）ｗｅｒｅ ３．８７，１．１３，４．４８，１．８７ａｎｄ ４．６７ｍｇ·Ｌ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓｏｎ Ｊｕｒｋａｔ ａｎｄ Ｕ２６６ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）ｗｅｒｅ ｍｏｓｔ ｏｂｖｉｏｕｓ．Ｔｈｅ ＩＣ５０ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ ｏｎ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ（４８ｈ）ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ４０ｍｇ·Ｌ－１，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｊｕｇｌｏｎｅ ｏｎ ｔｈｅｓｅ ｆｉｖｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｏｓｅ－ａｎｄ ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．ＦＣＭ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｊｕｇｌｏｎｅ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｋ５６２ｃｅｌｌｓ；ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｋ５６２ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ（４．５４±０．６）％，（１１．５ ４±０．６）％，（２８．７±０．３）％，（４５．０±１．２）％ａｎｄ６８４第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２（７６．１±１．４）％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ １，２，４，８ａｎｄ １６ｍｇ·Ｌ－１ ｊｕｇｌｏｎｅ ｆｏｒ ６ｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｊｕｇｌｏｎｅ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｋ５６２ｃｅｌｌｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｊｕｇｌｏｎｅ；ＭＴＴ ａｓｓａｙ；ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ 胡桃俗称核桃。
胡桃醌属于萘醌类，是存在于胡桃科植物胡桃及其同属植物黑核桃中的重要活性物质［１－２］，具有抗炎、抑菌和抗肿瘤作用。
胡桃醌主要用于抗肿瘤治疗，有研究［３］表明：胡桃楸提取液可直接抑制Ａ－５４９、ＨＴ－２９、ＮＣＩ、Ｈ４６０、Ｋ５６２和ＭＣＦ－７／ＡＤＲ多种肿瘤细胞，且其可能是通过抑制ＤＮＡ的合成，使线粒体空泡化和堵塞钾离子通道等方式抑制肿瘤细胞。
许多国家地区都曾用胡桃楸皮作为抗癌验方，但胡桃醌对白血病的影响尚缺乏深入研究，其确切的作用机制尚不清楚。
本研究采用ＭＴＴ法及流式细胞术观察胡桃醌对５种人白血病细胞株增殖的抑制效果和诱导细胞凋亡的作用，旨在阐明胡桃醌抗白血病的机制。
１ 材料与方法１．１ 主要试剂及仪器 胡桃醌（ｊｕｇｌｏｎｅ）购自Ｓｉｇｍａ公司；溴化四氮唑蓝（ＭＴＴ）购自美国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ公司；用ＰＢＳ配成５ｇ·Ｌ－１工作液，４℃避光保存；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为国产分析纯；Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ细胞凋亡检测试剂盒及碘化丙啶（ＰＩ）购自碧云天生物有限公司；ＲＰＭＩ－１６４０培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清（ＦＣＳ）购自杭州四季青公司。
酶标仪购自德国Ｂｉｏｔｅｃ公司，流式细胞仪（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）购自美国ＢＤ公司。
３．５ｍｇ胡桃醌溶于１００μＬ ＤＭＳＯ中，再用ＰＢＳ稀释成终浓度为３５０ｍｇ·Ｌ－１的胡桃醌母液，－２０℃保存备用。
三联溶液：在１９０ｍＬ三蒸水中加入十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ，电泳纯）２０ｇ，异丁醇（化学纯）１０ｍＬ及盐酸（分析纯）０．２ｍＬ，充分搅拌溶解后，室温下保存。
１．２ 细胞培养 人白血病Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ９３７、Ｕ２６６及ＮＢ４细胞株（本院肿瘤中心实验室保存）。
细胞在体积分数为５％ＣＯ２、３７℃培养箱中培养传代，于含１０％胎牛血清的ＲＭＰＩ－１６４０培养液中培养，每２～３ｄ传代１次。
１．３ ＭＴＴ比色法检测胡桃醌对白血病细胞生长的抑制作用 取对数生长期的上述５种细胞，调整细胞浓度至（４～５）×１０４ ｍＬ－１，接种于９６孔板，每孔加入１００μＬ。
培养２４ｈ后加入不同浓度梯度的药物及ＲＭＰＩ－１６４０，每孔加５０μＬ，胡桃醌设５个浓度（１、２、４、８和１６ｍｇ·Ｌ－１），各孔设６个平行孔。
在体积分数５％ＣＯ２、３７℃培养箱中，继续培养２４、３６和４８ｈ后，弃上清，每孔加１５μＬ的ＭＴＴ工作液，继续培养４ｈ后，每孔加１００μＬ三联溶液，５％ＣＯ２、３７℃培养箱中继续培养１２～１８ｈ，用酶标仪在参考波长４９０ｎｍ、检测波长５７０ｎｍ条件下测定吸光度（Ａ）值，以溶剂对照组处理的白血病细胞为对照组，用以下公式计算胡桃醌对肿瘤细胞的生长抑制率，ＩＣ５０＝ｌｇ－１｛Ｘｍ－Ｉ［∑Ｐ－（３－Ｐｍ－Ｐｎ）／４］｝，Ｘｍ：最大度的对数值；Ｉ：最大剂量比相临剂量的对数值；∑Ｐ：各组生长抑制率之和；Ｐｍ：最大阳性反应率；Ｐｎ：最小阳性反应率。
１．４ 流式细胞术Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ双染法检测细胞凋亡 分别用１、２、４、８和１６ｍｇ·Ｌ－１胡桃醌作用于Ｋ５６２细胞２ｈ，２ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ；用预冷１×ＰＢＳ（４℃）重悬细胞１次，２ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心６ｍｉｎ；去ＰＢＳ，加入１９５μＬ的Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ结合液悬浮细胞，加入５μＬ的Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ混匀后，避光，室温孵育１５ｍｉｎ；２ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ；吸弃ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ结合液，加入１９０μＬ的Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ结合液悬浮细胞，上机前５ｍｉｎ再加入５μＬ的ＰＩ染色；采用流式细胞术测定细胞凋亡率，实验重复３次，结果以凋亡细胞的百分率表示。