检测白血病细胞增殖力的 MTS pms 比色分析法的建立
MTS法检测细胞增殖活性
Promega Corporation ·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA1.Description (1)2.Product Components and Storage Conditions (4)3.Protocols (5)A.General Protocol (5)B.Example of a Protocol for Bioassay of IL-6 Using B9 Cells (5)4.General Considerations (6)A.Background Absorbance.....................................................................................6B.Optional Wavelengths to Record Data.............................................................7C.Lymphocyte Assays.............................................................................................8D.Reagent Optimization..........................................................................................8E.Cell Number Optimization (8)5.References (9)6.Related Products (9)1.DescriptionThe CellTiter 96®AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay (a)is a colorimetric method for determining the number of viable cells in proliferation or cytotoxicity assays. The CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent contains a novel tetrazolium compound [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS (a)] and an electron coupling reagent (phenazine ethosulfate; PES). PES has enhanced chemical stability, which allows it to be combined with MTS to form a stable solution. This convenient “One Solution” format is an improvement over the first version of the CellTiter 96®AQ ueous Assay, where phenazine methosulfate (PMS) is used as the electron coupling reagent, and the PMS Solution and MTS Solution are supplied separately.The MTS tetrazolium compound (Owen’s reagent) is bioreduced by cells into a colored formazan product that is soluble in tissue culture medium (Figure 1, 1).This conversion is presumably accomplished by NADPH or NADH produced by dehydrogenase enzymes in metabolically active cells (2). Assays are performed by adding a small amount of the CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent directly to culture wells, incubating for 1–4 hours and then recording the absorbance at 490nm with a 96-well plate reader (3,4).CellTiter 96®AQ ueous One Solution Cell Proliferation AssayAll technical literature is available on the Internet at: /tbs Please visit the web site to verify that you are using the most current version of this Technical Bulletin. Please contact Promega Technical Services if you have questions on useofthissystem.E-mail:********************.1.Description (continued)The quantity of formazan product as measured by the absorbance at 490nm is directly proportional to the number of living cells in culture (Figure 2). Because the MTS formazan product is soluble in tissue culture medium, the CellTiter 96®AQ ueous One Solution Assay requires fewer steps than procedures that usetetrazolium compounds such as MTT or INT (5,6). The formazan product of MTT reduction is a crystalline precipitate that requires an additional step in the procedure to dissolve the crystals before recording absorbance readings at570nm (7).If you currently use a [3H]thymidine incorporation assay, addition of theCellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent can be substituted for the pulse of[3H]thymidine at the time point in the assay when the pulse of radioactivethymidine is usually added. Bioassay data comparing [3H]thymidineincorporation to the MTS-based CellTiter 96®AQ ueous Assay and the original MTT-based CellTiter 96®Assay demonstrate that tetrazolium reagents can be substituted for [3H]thymidine incorporation (4,7).Advantages of the CellTiter 96®AQ ueous One Solution Assay include:•Easy-to-Use:Add the CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent to cells,incubate and read absorbance.•Convenient:Supplied as a single solution, filter-sterilized and ready for adding to assay plates.•Fast:Perform the assay in a 96-well plate with no washing or cell harvesting.Also eliminates solubilization steps normally required for MTT assays.•Non-Radioactive:Requires no scintillation cocktail or radioactive wastedisposal.Promega Corporation ·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USAFigure 1. Structures of MTS tetrazolium and its formazan product.N N N NSO 3OCH 2COOHMTS +SN CH 3CH 3N N N N H SO 3OCH 2COOH FormazanS NCH 3CH 31605M B 09_6A•Flexible:Plates can be read and returned to incubator for further color development.•Safe:Requires no volatile organic solvent to solubilize theformazanproduct (unlike MTT).Promega Corporation ·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USAFigure 2. Effect of cell number on absorbance at 490nm measured using theCellTiter 96®AQ ueous One Solution Assay. Various numbers of B9 hybridoma cells were added to the wells of a 96-well plate in RPMI containing 50μM 2-mercaptoethanol and supplemented with 5% FBS and 2ng/ml IL-6. The medium was allowed toequilibrate for 1 hour, then 20μl/well of CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent was added. After 1 hour at 37°C in a humidified, 5% CO 2atmosphere, the absorbance at 490nm was recorded using an ELISA plate reader. Each point represents the mean ± SD of 4 replicates. The correlation coefficient of the line was 0.993, indicating alinear response between cell number and absorbance at 490nm. The backgroundabsorbance shown at zero cells/well was not subtracted from these data.2 × 1044 × 1046 × 1048 × 1041 × 1051.2 × 1051.4 × 1051.6 × 105A b s o r b a n c e (490n m )Cells/Well1606M A 10_9A2.Product Components and Storage ConditionsProduct Size Cat.# CellTiter 96®AQ ueous One SolutionCell Proliferation Assay200 assays G3582 For Laboratory Use. Includes:•4ml CellTiter 96®AQ ueous One Solution ReagentProduct Size Cat.# CellTiter 96®AQ ueous One SolutionCell Proliferation Assay1,000 assays G3580 For Laboratory Use. Includes:•20ml CellTiter 96®AQ ueous One Solution ReagentProduct Size Cat.# CellTiter 96®AQ ueous One SolutionCell Proliferation Assay5,000 assays G3581 For Laboratory Use. Includes:•100ml CellTiter 96®AQ ueous One Solution ReagentStorage Conditions:For long-term storage, store the CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent at –20°C, protected from light. See the expiration date on the ProductInformation Label. For frequent use, solutions may be stored at 4°C, protected fromlight, for up to 6 weeks.Note:The performance of CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent after 10 freeze-thaw cycles was demonstrated to be equal to that of freshly prepared solution.Safety:To the best of our knowledge, the chemical, physical and toxicologicalproperties of this product have not been thoroughly investigated; therefore, werecommend the use of gloves, lab coats and eye protection when working with these orany chemicals.Light-Sensitivity:The CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent is light-sensitive andis supplied in an amber container. Discoloration may occur if solutions are exposed tolight outside of the container for several hours. This discoloration may cause slightlyhigher background 490nm absorbance readings, but it should not affect theperformance of the CellTiter 96®AQ ueous One Solution Assay.Promega Corporation·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA3.ProtocolsMaterials to Be Supplied by the User•96-well plates suitable for tissue culture•repeating pipettes, digital pipettes or multichannel pipettes•96-well plate reader3.A.General Protocol1.Thaw the CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent. It should takeapproximately 90 minutes at room temperature, or 10minutes in a waterbath at 37°C, to completely thaw the 20ml size.2.Pipet 20μl of CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent into each well ofthe 96-well assay plate containing the samples in 100μl of culture medium.Note:We recommend repeating pipettes, digital pipettes or multichannelpipettes for convenient delivery of uniform volumes of CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent to the 96-well plate.3.Incubate the plate at 37°C for 1–4 hours in a humidified, 5% CO2atmosphere.Note:To measure the amount of soluble formazan produced by cellularreduction of MTS, proceed immediately to Step 4. Alternatively, to measurethe absorbance later, add 25μl of 10% SDS to each well to stop the reaction.Store SDS-treated plates protected from light in a humidified chamber atroom temperature for up to 18 hours. Proceed to Step 4.4.Record the absorbance at 490nm using a 96-well plate reader.3.B.Example of a Protocol for Bioassay of IL-6 Using B9 Cells1.Maintain stock cultures of B9 cells in RPMI 1640 medium containing5%FBS, 50μM 2-mercaptoethanol (2-ME) supplemented with 5ng/mlhuman recombinant IL-6 . Subculture the stock cultures of cells to2×104cells/ml, and refeed with human recombinant IL-6 every 3 days orwhen a density of 2 × 105 cells/ml is reached.Note:B9 cells used for the bioassay should be from stock cultures 2 daysafter the last subculture (feeding with IL-6).2.Add 50μl/well of IL-6 samples or standards to be measured, diluted inRPMI 1640 medium containing 5% FBS and 50μM 2-ME. Start the titrationof the IL-6 standard at 4ng/ml in column 12, and perform serial twofolddilutions across the plate to column 2 (to 4pg/ml). (After the cellsuspension is added in Step 5 below, the final concentration of the titratedstandard will be 2ng/ml in column 12 to 2pg/ml in column 2.) Usecolumn1 for the negative control: RPMI 1640 medium (and supplements)without IL-6. Equilibrate the plate at 37°C in a humidified, 5% CO2atmosphere while harvesting the cells for assay.Promega Corporation·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA3.B.Example of a Protocol for Bioassay of IL-6 Using B9 Cells (continued)3.Wash the B9 cells twice in RPMI 1640 containing 5% FBS and 50μM 2-MEby centrifugation at 300 × g for 5 minutes.4.Determine cell number and viability (by trypan blue exclusion), andresuspend the cells to a final concentration of 1 × 105 cells/ml in RPMI 1640supplemented with 5% FBS and 50μM 2-ME.5.Dispense 50μl of the cell suspension (5,000 cells) into all wells of the plateprepared in Step 2. The total volume in each well should be 100μl.6.Incubate the plate at 37°C for 48–72 hours in a humidified, 5% CO2atmosphere.7.Add 20μl per well of CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent.8.Incubate the plate at 37°C for 1–4 hours in a humidified, 5% CO2atmosphere.Note:To measure the amount of soluble formazan produced by cellularreduction of MTS, proceed immediately to Step 9. Alternatively, to measurethe absorbance at a later time, add 25μl of 10% SDS to each well to stop thereaction. Store SDS-treated plates protected from light in a humidifiedchamber at room temperature for up to 18 hours. Proceed to Step9.9.Record the absorbance at 490nm using a 96-well plate reader.10.Plot the corrected absorbance at 490nm (Y axis) versus concentration ofgrowth factor (X axis). Determine the X-axis value corresponding to one-halfthe difference between the maximum (plateau) and minimum (no growthfactor control) absorbance values; this is the ED50value (ED50= theconcentration of growth factor necessary to give one-half the maximumresponse.)4.General Considerations4.A.Background AbsorbanceA small amount of spontaneous 490nm absorbance occurs in culture mediumincubated with CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent. The type of culturemedium used, type of serum, pH and length of exposure to light are variablesthat may contribute to the background 490nm absorbance. Backgroundabsorbance is typically 0.2–0.3 absorbance units after 4 hours of culture.Background absorbance may result from chemical interference of certaincompounds with tetrazolium reduction reactions. Strong reducing substances,including ascorbic acid, or sulfhydryl-containing compounds, such asglutathione, coenzyme A and dithiothreitol, can reduce tetrazolium saltsnonenzymatically and lead to increased background absorbance values.Culture medium at elevated pH or extended exposure to direct light also maycause an accelerated spontaneous reduction of tetrazolium salts and result inincreased background absorbance values. If phenol red containing medium is Promega Corporation·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USAused, an immediate change in color may indicate a shift in pH caused by thetest compounds. Specific chemical interference of test compounds can beconfirmed by measuring absorbance values from control wells containingmedium without cells at various concentrations of test compound.Background 490nm absorbance may be corrected as follows: Prepare atriplicate set of control wells (without cells) containing the same volumes ofculture medium and CellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent as in theexperimental wells. Subtract the average 490nm absorbance from the “no cell”control wells from all other absorbance values to yield corrected absorbances.4.B.Optional Wavelengths to Record DataFigure 3 shows an absorbance spectrum of the formazan product resultingfrom reduction of MTS. We recommend recording data at the absorbance peakof 490nm; however, if your 96-well plate reader does not have a 490nm filter,data can be recorded at wavelengths of 450–540nm. Absorbance may berecorded at other wavelengths if necessary, but loss in sensitivity will result. Areference wavelength of 630–700nm may be used to subtract backgroundcontributed by excess cell debris, fingerprints and other nonspecific absorbance.Promega Corporation ·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USAFigure 3. Absorbance spectrum of MTS/formazan. The absorbance spectrum of the formazan product resulting from reduction of the MTS tetrazolium compoundshows an absorbance maximum at 490nm. The negative absorbance values (382nm)correspond to the disappearance of MTS as it is converted into formazan.A b s o r b a n c e Wavelength (nm)3.002.502.001.501.000.500.00-0.503004005006007002284M A 07_8A4.C.Lymphocyte AssaysLymphocytes may produce less formazan than other cell types (8). To achievesignificant absorbance changes with lymphocytes, increase the number ofcells to approximately 2.5–10 × 104cells/well and incubate the plate withCellTiter 96®AQ ueous One Solution Reagent for the entire 4-hour period.4.D.Reagent OptimizationThe concentrations of tetrazolium and electron transfer reagents have beenoptimized for general use with a wide variety of cell lines cultured in 96-wellplates containing 100μl of medium. If different volumes of culture medium areused, adjust the volume to maintain a ratio of 20μl CellTiter 96®AQ ueous OneSolution Reagent per 100μl culture medium. This reagent:medium ratio resultsin a final concentration of 317μg/ml MTS in the assay wells. Minor variationsin the optimum concentrations of tetrazolium and electron transfer reagentsoccur with different cell lines; however, assay sensitivity is seldomcompromised using the formulation in the CellTiter 96®AQ ueous One SolutionReagent. If reagent optimization is critical to your assay procedure, werecommend using the CellTiter 96®AQ ueous Non-Radioactive Cell ProliferationAssay (Cat.# G5421, G5430, G5440) or the CellTiter 96®AQ ueous MTS ReagentPowder products (Cat.# G1111, G1112) that supply the chemicals separately.4.E.Cell Number OptimizationCell proliferation assays require cells to grow over a period of time. Therefore,choose an initial number of cells per well that produces an assay signal nearthe low end of the linear range of the assay. This helps to ensure that the signalmeasured at the end of the assay will not exceed the linear range of the assay.This cell number can be determined by performing a cell titration as shown inFigure 2.Different cell types have different levels of metabolic activity. Factors that affectthe metabolic activity of cells may affect the relationship between cell numberand absorbance. Anchorage-dependent cells that undergo contact inhibitionmay show a change in metabolic activity per cell at high densities, resulting ina nonlinear relationship between cell number and absorbance. Factors thataffect the cytoplasmic volume or physiology of the cells will affect metabolicactivity.For most tumor cells, hybridomas and fibroblast cell lines, 5,000 cells per wellis recommended to initiate proliferation studies, although fewer than 1,000 cellscan usually be detected. The known exception to this is blood lymphocytes,which generally require 25,000–250,000 cells per well to obtain a sufficientabsorbance reading.Promega Corporation·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA5.References1.Barltrop, J.A. et al.(1991) 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimenthylthiazoly)-3-(4-sulfophenyl)tetrazolium, inner salt (MTS) and related analogs of3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reducing to purplewater-soluble formazans as cell-viability indicators. Bioorg. Med. Chem. Lett.1, 611-4.2.Berridge, M.V. and Tan, A.S. (1993) Characterization of the cellular reduction of3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): Subcellularlocalization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electrontransport in MTT reduction. Arch. Biochem. Biophys.303, 474–82.3.Cory, A.H. et al.(1991) Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cellgrowth assays in culture. Cancer Commun.3, 207–12.4.Riss, T.L. and Moravec, R.A. (1992) Comparison of MTT, XTT, and a noveltetrazolium compound for MTS for in vitro proliferation and chemosensitivity assays.Mol. Biol. Cell (Suppl.)3, 184a.5.Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods65, 55–63.6.Bernabei, P.A. et al.(1989) In vitro chemosensitivity testing of leukemic cells:Development of a semiautomated colorimetric assay. Hematol. Oncol.7, 243–53.7.CellTiter 96®Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Technical Bulletin#TB112,Promega Corporation.8.Chen, C.-H., Campbell, P.A. and Newman, L.S. (1990) MTT colorimetric assay detectsmitogen responses of spleen but not blood lymphocytes. Int. Arch. Allergy Appl.Immunol.93, 249–556.Related ProductsMTS/MTT-Based Cell Viability Assay SystemsProduct Size Cat.# CellTiter 96®AQ ueous Non-RadioactiveCell Proliferation Assay1,000 assays G54215,000 assays G543050,000 assays G5440 CellTiter 96®AQ ueous MTS Reagent Powder*250mg G11121g G1111 CellTiter 96®Non-RadioactiveCell Proliferation Assay1,000 assays G40005,000 assays G4100For Laboratory Use. *PMS is not supplied with MTS Reagent Powder and must beobtained separately.Promega Corporation·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA6.Related Products (continued)Luminescent-Based Cell Viability Assay SystemProduct Size Cat.# CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay10ml G757010 × 10ml G7571100ml G757210 × 100ml G7573Resazurin-Based Cell Viability Assay SystemProduct Size Cat.# CellTiter-Blue®Cell Viability Assay20ml G8080100ml G808110 × 100ml G8082Fluorescent-Based Cell Viability AssayProduct Size Cat.# CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay10ml G60805 × 10ml G60812 × 50ml G6082For Laboratory Use.Cytotoxicity Assay Systems (LDH)Product Size Cat.# CytoTox-ONE™ HomogeneousMembrane Integrity Assay200–800 assays G78901,000–4,000 assays G7891 CytoTox 96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay*1,000 assays G1780 CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay*10ml G92905 × 10ml G92912 × 50ml G9292*For Laboratory Use.Promega Corporation·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USAApoptosis Assay SystemsProduct Size Cat.#Apo-ONE®Homogeneous Caspase-3/7 Assay1ml G779210ml G7790100ml G7791 Caspase-Glo®2 Assay*10ml G094050ml G0941 Caspase-Glo®6 Assay*10ml G097050ml G0971 Caspase-Glo®3/7 Assay* 2.5ml G809010ml G8091100ml G8092 Caspase-Glo®8 Assay* 2.5ml G820010ml G8201100ml G8202 Caspase-Glo®9 Assay* 2.5ml G821010ml G8211100ml G8212CaspACE™ Assay System, Colorimetric*50 assays G7351100 assays G7220 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System60 reactions G3250 DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System40 reactions G713020 reactions G7360*For Laboratory Use.Apoptosis ReagentsProduct Size Cat.# CaspACE™ FITC-VAD-FMK In Situ Marker50μl G7461125μl G7462Anti-ACTIVE®Caspase-3 pAb50μl G7481Anti-Cytochrome c mAb100μg G7421Anti-pS473Akt pAb40μl G7441Anti-PARP p85 Fragment pAb50μl G7341 Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK125μl G723250μl G7231 Caspase Inhibitor, Ac-DEVD-CHO100μl G5961 Promega Corporation·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA6.Related Products (continued)Viability and Cytotoxicity AssayProductSize Cat.#MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay 10ml G92005 × 10ml G9201(live/dead cell protease activity determination) 2 × 50ml G9202CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay 10ml G92605 × 10ml G9261(dead cell protease activity determination) 2 × 50ml G9262MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay 10ml G92705 × 10ml G9271(live/dead cell protease activity determination) 2 × 50ml G9272For Laboratory Use.Promega Corporation ·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA(a)The MTS tetrazolium compound is the subject of U.S. Pat. No. 5,185,450 assigned to the University of South Florida and islicensed exclusively to Promega Corporation.© 1996, 1998, 1999, 2004, 2005, 2007 Promega Corporation. All Rights Reserved.Anti-ACTIVE, Apo-ONE, Caspase-Glo, CellTiter 96, CellTiter-Blue, CellTiter-Glo and CytoTox 96 are registered trademarks of Promega Corporation. CaspACE, CellTiter-Fluor, CytoTox-Fluor, CytoTox-Glo, CytoTox-ONE and DeadEnd are trademarks of Promega Corporation.Products may be covered by pending or issued patents or may have certain limitations. Please visit our Web site for more information.NEN is a registered trademark of NEN Life Science Products, Inc.All prices and specifications are subject to change without prior notice.Product claims are subject to change. Please contact Promega Technical Services or access the Promega online catalog for the most up-to-date information on Promega products.。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
MTT实验法测定细胞增殖
MTT实验法测定细胞增殖1.实验材料1.1. 实验细胞株癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔2～3天进行一次细胞传代。
1.2 药物与试剂RPMI-1640 培养基DMSO 胰蛋白酶粉1-甲基乙内酰脲5-氟尿嘧啶MTT 粉甘油碘化丙啶(PI)新生小牛血清1.3 仪器设备超净工作台（SW-CJ-2FD 型）超低温电冰箱恒温水浴箱低温高速离心机恒温震荡摇动床-20℃电冰箱光学显微镜电子天平Eppendorf 移液枪（10、100、1000ul）去离子纯水仪流式细胞仪低温数控高速离心机普通离心机1.4 主要试剂配方1.4.1 PBS 溶液磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、氯化钾(KCl)0.2g，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为1.0L。
再使用盐酸将PH 值调至7.4，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4℃内保存。
临用前要在37℃水浴加热。
1.4.2 细胞培养基称取RIPM-1640 培养基粉10.4g，用 1.0L ddH2O 溶解，再往溶液中加入2g NaHCO3，再用盐酸将PH 值调整至7.0，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为10%。
每次临用前要将含有10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640 培养基置于37℃水浴箱中加热。
1.4.3 新生小牛血清临用前，将新生小牛血清置于56℃水浴中灭活30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20℃冰箱中保存。
1.4.4 胰蛋白酶在100ml 的PBS 溶液中加入胰蛋白酶粉0.25g，置于4℃冰箱中过夜，用直径为0.22μm 微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封，置于4℃冰箱中保存。
1.4.5 MTT 溶液(5mg/ml)往50ml 无菌PBS 中加入250mg MTT 粉，轻轻摇匀，使MTT 粉充分溶解，予用直径为0.22μm 微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于4℃冰箱中临时保存（≤7 天），置于-20℃冰箱中短期保存（≤1 月）。
PH1700 MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒实验操作方法手册
应用
细胞增殖；细胞毒性；凋亡结果 化学灵敏性 细胞Components MTS Solution 250 assays 2.5ML 500 assays 5ML
保存 2-8℃避光保存。长期不用的分装后于-20℃避光保存，避免反复冻融。有效期一年。
使用方法
活性测定使用方法： 1、收集细胞，加细胞悬液 100ul（约 5000-10000 个细胞）到 96 孔板（边缘孔用无菌水或 PBS 填充）。每板设对照（加 100μl 培养基）。 2、置 37℃，5% CO 2 孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入 10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入 10 ul MTS 溶液，37℃孵育 1-4 小时。 5、测定 490 nm 各孔的吸光值。 6、同时设置空白孔（培养基和 MTS 溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和 MTS 溶液，有细胞），每组设定 3-5 复 孔。 结果分析 细胞活力计算 将各测试孔的 OD 值减去调零孔 OD 值或对照孔 OD 值。各重复孔的 OD 值取平均数。 细胞活力% =（加药细胞 OD-空白 OD/对照细胞 OD-空白 OD）×100 数量测定使用方法： 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2、按比例 (例如：1/2 比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复 孔。 3、接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后加 MTS 试剂培养一定时间后测定 O.D 值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X 轴)，O.D 值为纵坐标 (Y 轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是 实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 MTS 后的培养时间)。
mts法检测细胞增殖的原理
mts法检测细胞增殖的原理细胞增殖作为生物学领域中一个重要的研究课题，对于了解细胞生长、疾病发展等方面具有重要意义。
而衡量细胞增殖的效果和速度，通常需要借助各种细胞增殖检测方法。
其中，MTS法是一种常用的细胞增殖检测方法，通过测量细胞代谢产生的溶液颜色强度来评估细胞数量变化。
本文将探讨MTS法检测细胞增殖的原理以及其在细胞生物学研究中的应用。
MTS法的原理基于细胞代谢产生的代谢产物可以与试剂中的显色剂产生反应，形成有色产物。
在细胞增殖实验中，研究者向细胞培养基中加入MTS试剂后，细胞将代谢MTS试剂，形成有色产物，其颜色深浅与细胞数量呈正相关关系。
通过光谱仪或酶标仪检测产物的吸光度，就可以间接评估细胞增殖的情况。
相比于其他细胞增殖检测方法，MTS法具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点。
首先，MTS法无需加入放射性同位素或染料，对细胞无毒性影响，适用于长期监测细胞增殖情况。
其次，MTS法对于细胞数量的检测灵敏度高，可以检测到上千个细胞的数量变化，因此在细胞增殖动态监测方面具有很好的应用价值。
另外，MTS法的试剂成本低廉，适用于高通量筛选和大规模细胞增殖实验。
在细胞生物学研究中，MTS法广泛应用于细胞增殖实验、药物筛选、毒性检测等方面。
在细胞增殖实验中，研究者可以通过MTS法评估细胞在不同处理条件下的增殖情况，进而探究细胞增殖相关的信号通路、蛋白质表达等变化。
在药物筛选实验中，MTS法可以评估不同药物对细胞增殖的影响，帮助筛选出具有细胞毒性或促进细胞增殖作用的药物。
在毒性检测方面，MTS法可以用来评估化合物对细胞代谢的影响，从而评估其对细胞生存和增殖的影响。
尽管MTS法在细胞增殖检测中具有很好的应用前景，但也存在一些局限性。
首先，MTS法对于细胞数量的检测范围有限，适用于较短时间内快速增殖的细胞类型，对于增殖速度缓慢或需要较长时间才能显示增殖效应的细胞类型则可能不够敏感。
其次，MTS法对于细胞代谢产物的稳定性要求较高，容易受到细胞内环境的影响而出现误差。
细胞增殖检测方法简介
细胞增殖检测方法简介1.检测细胞代谢活性检测细胞的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。
在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，而活性的脱氢酶可以使得外源性的四唑盐或者阿尔玛蓝(Alamar blue)还原成为带有颜色还原产物。
通过分光光度计或者酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。
四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1，其还原产物为甲瓒(formazan)。
(1)四甲基偶氮唑盐法(MTT)：MTT商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。
1983年Mosmann 建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。
其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶，甲瓒并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。
二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT可以用于所有细胞类型，但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSC)中。
因此，MTT主要作为终点检测方法。
另外，有研究发现过氧化物会降低MTT测定的准确度，抑制将近95％的MTT与O2-的反应，MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。
(2)二甲氧唑黄比色法(XTT)：XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞还原形成水溶性的橘黄色的甲瓒产物，不形成颗粒，可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度，故较MTT法更加快速、简便、敏感。
但XTT水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用。
由于XTT的代谢产物呈橘黄色，故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果。
与MTT一样，过氧化物可抑制近95％的XTT与O2-的反应，故对XTT测定的准确度有一定的影响。
(3)内盐法(MTS)：MTS是一种新型的MTT类似物。
MTs在偶联剂PMS存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、宇文皓月二、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必须物质。
用同位素3H标识表记标帜TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标识表记标帜物。
CFSE进入细胞后可以不成逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标识表记标帜荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标识表记标帜物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标记检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
MTT使用讨论总结(附MTS测定方法)
/dxymurong > 复制 > 收藏 | 手机看个人门户登录 | 注册 | 和讯博客 | 和讯首页樱桃红了欢迎来到樱桃园个人门户博客微博相册音乐转帖邮箱朋友圈好友留言进入我的家联系主人发送私信 | 给主人留言 | 送小礼物 | 关注主人 | 加为好友 | 进入Ta的家主人：dxymurong [发送私信] [加为好友] [关注]快速链接[和讯博客][发表文章][博客设置][文章管理]搜索分类友情链接MTT使用讨论总结（附MTS测定方法） [转贴 2005-04-09 16:17:59]字号：大 中 小文章来源: 丁香园一、关于眙盼蓝、MTT、H3测定细胞增殖程度的问题xuweilai近期看文献发现国外一些文献仅采用眙盼蓝计数法测定细胞增殖程度，多本书上明确说明这是一种很不准确的方法，可是文章照样能发在BLOOD等杂志上，对此本人有些想不通。
本实验室也有人据此而仅采用眙盼蓝计数法测定细胞增殖程度，做药物对细胞株生长的影响时，我想细胞增殖程度应该是比较重要的指标，怎可马虎行事。
请高手指点迷津！bengbu_bli 用普通血球计数板计数增殖细胞的数量， 只要检测的细胞样本数量不是非常大，只要能够数得过来，而且一般来讲，都是熟练者计数的话，应该是比MTT法要准确的多。
据了解，国外许多档次不低的杂志都是认可这种经典或传统计数细胞的方法的。
midas丁香园主任是的，只要idea巧妙有创意，而用于证明他们的方法都是次要的！diandian眙盼蓝、MTT确实不是一个好的方法，国外的许多杂志已不太使用，国内还认可的。
关键是整篇文章的思路和结构，好的idea是很重要的。
我的一个师姐的文章就被提出眙盼蓝、MTT的问题，但最后编委认为整篇文章的思路很好，也就不计较眙盼蓝、MTT的问题了。
实属兴运。
杂志Cancer Research Therapywm_ni丁香园主任国内由于实验条件的问题，应用H3的还是不多，而以MTT为主，以我的经验眙盼蓝计数法误差确实很大，所以不知道bengbu_bli的观点源自何处，另外如果有一个好的idea，如果不能用好的方法去证实，实在是一种遗憾，当然发不发还是要看编辑了。
热点实验：细胞增殖毒性与Transwell(细胞迁移、侵袭)实验案例介绍
Transwell细胞迁移与侵袭实验服务：细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
细胞增殖与毒性检测MTT检测实验服务：原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT方法用于判断药物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用，以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞活力、增殖、凋亡等方面）。
细胞增殖与毒性检测SRB检测实验服务：磺酰罗丹明是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中的量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。
在515nm波长处的OD值与活细胞数呈良好的线性关系。
SRB法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
细胞增殖与毒性检测CCK-8检测实验服务：Cell Counting Kit简称CCK8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。
颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。
原来检测细胞增殖，方法这么多（上）
原来检测细胞增殖，方法这么多（上）细胞增殖检测实验的意义细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。
增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化，进而反应细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。
肿瘤细胞增殖和转化过程细胞增殖检测实验的分类细胞增殖检测实验根据实验方案和目的不同分为以下几种：1. 细胞代谢活性检测通过检测活细胞相关的物质的含量（如蛋白质、酶）等间接地测定待活细胞的数量来评价细胞的增殖能力。
•特点：间接的方法，反应的是细胞活性而非是否在增殖；•常见实验举例：MTT、XTT、MTS、CCK8法及SRB法；•应用：细胞活力、药物作用的毒性，适合高通量分析实验。
2. 细胞DNA合成检测通过测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力。
•特点：直接测定DNA合成是检测细胞增殖最准确方法；•常见实验举例：BrdU和EdU；•应用：细胞DNA修复，分化及细胞标记物追踪等。
3. ATP浓度检测利用荧光素酶Luciferase反应细胞ATP的含量，进而反应细胞活性。
•特点：结果灵敏；•常见实验举例：荧光素酶催化反应；•应用：高通量细胞增殖检测和筛选。
4. 细胞增殖相关抗原检测通过检测增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA等常作为人体细胞增殖的标志。
•特点：反应体内肿瘤细胞的增殖能力，但是需组织切片不适合高通量；•常见实验举例：细胞增殖的标志物的免疫组化等；•应用：体内肿瘤组织。
5. 染料排斥法活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。
适合少量细胞的统计，广泛用于绘制细胞生长曲线等。
以上方法我们一般是根据你的实验目的，细胞类型来决定最终的选择。
本期我们先为大家介绍了一下，第一大类：基于细胞代谢活性的检测：包括酶活如MTT、MTS、CCK8等；蛋白含量的SRB实验。
又可统称为比色法，主要基于颜色的变化来反应细胞数量，十分适合高通量药物筛选，进而计算药物的IC50。
MTS／PMS比色分析方法测定LA795细胞活性的实验条件
Ｉ５ 数据处理 ．
２ 结 果
采用 Ｓ Ｓ １． 进行处理 ， Ｐ Ｓ ３０ 计算相关系数等 。
在细胞浓度 为（．５ ） Ｏ ２ ～４ ×
２ １ 最 佳 不 同 细 胞 浓 度 的确 定 ．
１‘ｍｌ 围 内 ， 测 定 的 ＯＤ值 随细 胞 浓 度 的 增 加 而 增 加 ，一 ０／ 范 所 ｒ
应 用 。 １８ 年 ， ｓ ｎ Ｌ建 立 了 ＭＴ 比 色 法 ， Ｔ 比色 方 ９ ３ Ｍｏｍａ ｎ３ Ｔ ＭＴ
MTT在细胞增殖检测中最佳实验条件的研究_李红艳
进行康复的关键， ＭＴＴ 法已成为目前用于抗癌药物 筛选和临床肿瘤药敏试验的常用方法。但由于 ＭＴＴ 经活细胞线粒体脱氢酶转化生成的蓝紫色结晶物需 加入二甲基亚砜溶解后方能比色， 操作步骤繁琐易 对实验结果造成影响。国外新近报道 ［４－５］ 了 ＭＴＳ、 ＷＳＴ－ １ 两种即用型试剂， 它们经活细胞线粒体脱氢 酶转化成水溶性有色物质， 可直接进行比色， 从而减
析纯） ； 胎牛血清（ 天津市川页生化制品有限公司） ； １．３ 统计学分析
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＩＲ）。
实验所得数据应用 ＳＰＳＳ 统计软件进行处理。用
１．１．３ 仪器： 全自动酶标仪（ 上海雷勃分析仪器有限 相关分析检验各实验方法 ＯＤ 值 （ 吸光度） 的相关
公司 ＭＫ３ 型酶标仪） 。
性， 以 ｔ 检验进行差异性分析。
选抗癌新药提供更可靠的方法， 以期促进化疗在恶 ＷＳＴ－ １ 组可直接比色， ＭＴＴ 组倒去培养液小心吸干
性肿瘤防治与康复的进一步发展。
各孔， 加入 ＤＭＳＯ １５０"Ｌ 室温放置 １０ｍｉｎ， 各实验组
比 色 前 均 振 荡 ５ｍｉｎ， 三 组 分 别 用 ４５０ｎｍ、４９２ｎｍ、
１ 材料与方法
６３０ｎｍ 波长进行比色。
８２４ 中国康复医学杂志， ２００５ 年， 第 ２０ 卷， 第 １１ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｎｏｖ． ２００５， Ｖｏｌ． ２０， Ｎｏ．１１
·基础研究·
ＭＴＴ、ＭＴＳ、ＷＳＴ－ １ 在细胞增殖检测中 最佳实验条件的研究
李红艳 １ 夏启胜 １ 徐 梅 １ 房 青 １ 徐 波 １ 陈志华 １ 向 青 １
１．１ 材料
１．２．２ 最 佳 时 间 的 选 择 ： 选 择 最 适 细 胞 浓 度 １．５×
细胞生长检测方法：MTS检测法
细胞生长检测方法：MTS检测法
细胞生长检测方法：MTS检测法
1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL -3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。
2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104 ～2×104 上述细胞之一的DMEM培养液（加10％小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5％ CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。
4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。
5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。
在酶联检测仪上，波长570n m（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。
用样品稀释度对OD值（OD570 、OD490 或OD570 /OD690 ）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。
抑制白血病干细胞扩增的新策略设计数量主效筛查
抑制白血病干细胞扩增的新策略设计数量主效筛查白血病是一种由于异常增殖的白血病干细胞导致的血液恶性肿瘤。
传统的治疗方法对于白血病干细胞的控制效果有限，因此设计新的策略来抑制白血病干细胞的扩增变得尤为重要。
本文旨在探讨抑制白血病干细胞扩增的新策略设计，并提出数量主效筛查的方法。
白血病干细胞（Leukemic Stem Cells, LSCs）是白血病起始和复发的主要原因。
LSCs具有自我更新和多向分化的能力，同时也能够逃避免疫应答和常规化疗的杀伤作用。
因此，寻找有效的方法来抑制LSCs的扩增具有重要的临床意义。
首先，针对LSCs的特性，我们可以考虑通过靶向LSCs的自我更新和多向分化机制来抑制其扩增。
一种可行的策略是利用小分子化合物来干预LSCs的自我更新，并推动其向有益或非有害细胞系分化。
这一策略可以通过荧光素酶报告基因检测来验证其对LSCs的抑制效果，进而来筛选出对LSCs具有主效的分子。
其次，针对LSCs脱离免疫监视和对化疗耐药的特性，可以采取免疫疗法来增强对LSCs的杀伤作用。
免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞疗法被成功应用于其他种类的肿瘤治疗中，因此可以尝试将这些方法应用于LSCs。
通过设计合适的抗体或CAR-T细胞，以及选择合适的靶向表面标志物，可以实现对LSCs的精确杀伤，有效控制其扩增。
最后，为了抑制LSCs对常规化疗的耐药性，可以寻找和设计合适的化合物来与常规化疗药物协同作用。
目前已有研究证明通过联合应用特定的化合物和化疗药物可以增强对白血病的治疗效果，这一策略也可以尝试应用于控制LSCs的扩增。
通过设计数量主效筛查实验，我们可以筛选出对LSCs 有协同作用的化合物，并进一步验证其对LSCs扩增的抑制效果。
综上所述，抑制白血病干细胞扩增的新策略设计是一个具有挑战性但非常关键的研究领域。
通过针对LSCs的特性设计策略，如干预自我更新和分化、增强免疫监视、协同化疗药物等，可以有效地抑制LSCs的扩增，进而提高白血病的治疗效果。
细胞增殖的检测方法_石淙
3H-TdR 掺入法的放射性对试验者有一定的危 害；MTT 法由于产生了不溶性的甲瓒，检测步骤复 杂且结果不准确；XTT 法虽克服了这个缺点，但其 桔黄色的水溶性甲瓒产物亦影响结果的检测，且 与 MTT 一样均受过氧化物的影响；MTS 法的检测 原理类似 MTT 与 XTT，虽结果较二者准确，但检测 结果易受外界环境影响，试剂蒸发影响其准确性； WST-1 是 MTT 的升级产品，其试剂和产物均属水 溶性，试剂本身稳定性更好，产物的水溶性比 XTT 与 MTS 更高， 因此结果更稳定更准确， 灵敏度更 高；CCK-8 由于含有较 WST-1 更新的 WST-8，细 胞毒性低，方法更简单，灵敏度、准确性和重复性 更好，尤其是被检测的细胞可重复利用，利用价值 更高。
[5]Ahmadian S, Barar J, Saei A A, et al. Cellular toxicity of nanogenomedicine in MCF-7 cell line: MTT assay [J]. J Vis Exp, 2009(26).
反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找 到最佳测定时间。 6 Ce ll Counting Kit- 8(CCK- 8)
CCK-8 试剂中含有 WST-8。 WST-8 是近年新 开发的一种较 WST-1 更新的水溶性四唑盐，检测 原理与 WST-1 类似，但较 WST-1 更稳定，灵敏度 更高，溶解性更强，更易于保存。 CCK-8 检测细胞 增殖、细胞毒性实验的灵敏度比 MTT、XTT 及 MTS 更高，数据可靠，重复性好，操作简便，且无需放射 性同位素和有机溶剂，对细胞几乎没有毒性。 尤其 适合于悬浮细胞，高通量药物筛选。 该方法已应用 于生物活性因子的活性检测、 大规模抗肿瘤药物 的 筛 选 、细 胞 增 殖 检 测 以 及 细 胞 毒 性 试 验 等 。 [30-32] 与 MTT 法相比，CCK-8 法操作更简便，灵敏度、准 确性和重复性均更好[33]。 更重要的是 CCK-8 法细 胞毒性低，细胞检测后还可重复利用，具有更好的 实用性，可替代 MTT 法，具有良好的应用前景[34]。 7 小结
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。
一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。
另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。
显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。
如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。
所以最直接的证据应该采用方法一。
用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。
若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。
但更为常用的方法是BrdU检测法。
用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。
细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。
Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。
比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。
而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。
1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。
BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。
有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。
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检测白血病细胞增殖力的MTS/pms比色分析法的建立陈秀生,方铁兰,蔡瑞波1,郭桂兰1(陕西省人民医院老年病研究中心,西安710068;1西安交通大学第一医院血液病中心,西安710061)摘要 为了探讨建立一种更为快速、安全、灵敏的白血病细胞增殖力的检测方法,本研究应用HL260和K562细胞可转化M TS/pms形成水溶性待测产物,其光密度值在492nm波长下半自动测定的特点,研究了M TS/pms比色分析法取代M TT和IN T用于白血病细胞增殖力的检测。
结果表明,只有活的白血病细胞才能转化M TS/pms形成待测产物,且白血病细胞数与所测光密度值(OD)之间具有良好的相关性(r=0.963);与M TT和IN T法相比较,M TS/pms比色分析法中所形成的最终待测产物为水溶性,省略了上清液去除和加入有机溶剂的步骤。
结论: M TS/pms比色分析法对白血病细胞增殖力的检测更具有快速、安全、准确、灵敏的优点。
关键词 白血病细胞;HL260细胞;K562细胞;细胞增殖;M TS/pms比色分析法中图分类号 R46611;R3311142Development of MTS/pms Colorimetric Assay in the Proliferation of Leukemic CellsCHEN Xiu2Sheng,FAN G Tie2Lan,CA I Rui2Bo1,GUO Gui2Lan1(Research Center of Gerontology,S hanxi Provi ncial People′s Hospital,Xian710068,Chi na;1Research Center of Hematology,The Fi rst Hospital,Xian Jiaotong U niversity,Xian710061,Chi na)Abstract In order to establish a new more rapid,safe and sensitive colorimetric assay for the proliferation of leukemic cells,M TS/pms has been developed.This automated colorimetric assay is based on the characteristic of viable and metabolically active leukemic cells to cleave M TS/pms into a water2soluble product whose optical density is determined at 492nm by an automated microtiter2plate reader photometer.The results indicated that only active leukemic cells cleaved M TS/pms into product measured,and dead cells did not reduce M TS/pms.A linear relationship were found between the viable cell number and optical density of M TS/pms cleaved by HL260and K562cell(r=0.963).Compared with M TT and IN T assays,the reduced product of M TS/pms is water2soluble.It is concluded that M TS/pms colorimetric assay is more rapid,accurate and sensitive for the bioassay of proliferation of leukemic cells.K ey w ords leukemic cell;HL260cell;K562cell;cell proliferation;M TS/pms colorimetric assy前 言目前应用于白血病细胞增殖力检测的方法主要包括有集落法、同位素掺入法和比色分析法。
在临床和实验室研究中较为普遍使用的是四氮唑盐比色分析法(M TT和IN T法)[1-5]。
但M TT和IN T比色分析法也有不少缺点,所测定的产物多以结晶形式存在,又需使用易挥发的、有毒的有机溶剂二甲亚砜或使用无毒的醇类溶剂,但溶解不完全,影响了这些方法的灵敏度和准确性。
M TS是另一种M TT 类似物,在pms共同存在下,可被活的、有增殖能力的细胞转化为水溶性产物。
本研究探讨建立一种水溶性待测产物的M TS/pms比色分析法用于白血病细胞增殖力的检测。
材料与方法细胞HL260和K562白血病细胞,1×105细胞/毫升,在含10%胎牛血清(FCS)的RPM I1640培养液, 37℃,5%CO2,饱和湿度,孵育48小时,备用。
MTS/pms,MTT和INT配制M TS[32(4.52dimethylthiazol222yl)252(32carbo2 xy2methoxyphenyl)222(242sulfophenyl)22H2tetrazo2 lium,inner salt]和pms(phenazine methosulfate)由美国南佛罗里达大学Owen实验室提供。
二者分别用Dulbecco′s PBS(Sigma)配制成6mmol/L 通讯作者:陈秀生 电话:(029)5249640-2603.传真:(029) 5230739.E2mail:lac65126@・834・中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2002;10(5):438-440M TS和0.33mmol/L pms4℃避光保存,于1周内使用。
MTT[32(4.52dimethylthiazol222y1)22,52diphe2 nyltetrazolium bromide](Sigma)以双蒸水配制2 mg/ml的溶液,4℃备用。
IN T[2242iodophenyl232(42nitrophenyl)252phenyl2 tetrazolium chloride],双蒸水配制成1mg/ml溶液, 4℃备用。
微量培养检测白血病细胞增殖力(MTS/pms 法,MTT法和INT法)HL260或K562细胞,孵育48小时,调整细胞至所需实验浓度,取0.2ml加入96孔培养板。
每组设3个平行复孔按实验要求加入M TT20微升/孔,IN T20微升/孔,M TS/pms按100∶1比例20微升/孔,37℃,5%CO2,饱和湿度,孵育6小时后,加1N HCl10微升/孔,用2550型自动酶联检测仪测定光密度值。
结 果H L260和K562白血病细胞对MTS/pms转化能力检测结果表明,只有活的细胞才有转化底物M TS/ pms的能力,且白血病细胞数与光密度值之间量呈良好的相关性(r=0.963)。
随着种植细胞数的增加,底物M TS/pms转化为产物也随之增加,光密度值也增大,M TS/pms的转化能力完全与白血病细胞数量和白血病细胞的增殖力呈正相关(表1和图1)。
T able1 Absorb ance at w avelenghth492nm of cell suspen2 sions after H L260and K562cells incub ation with MTS/pms for6-8hoursCells@Mean of absorbanceHL2600.654HL260(60℃heat2killed)0.002K5620.551K562(60℃heat2killed)0.002Blank(RPMI1640medium+20% FCS+1N HCl)0.001 @cell density:2×104cells per well白血病转化底物MTS/pms的时间动力学图2所示,一定浓度底物在一定的孵育时间(2 -8小时)范围内,随着时间的延长,待测产物的光密度值也随之增加,当底物与白血病细胞孵育时间达到8-10小时,光密度值增加达峰值,提示最佳测定时间在底物与细胞孵育的第6小时左右。
Figure1 The relation of cell density and its optical density in MTS/pms colorimetricassayFigure2 Time course of MTS/pms cleavage by H L260and K562cells.An experiment done in triplicate is presented用于白血病细胞增殖力检测的MTS/pms比色分析法与MTT和INT法的比较结果表明,3种方法在使用测定波长、底物配制最适浓度和结晶的形成与否有较大区别(表2)。
在种植细胞数相同时,M TS/pms法所测光密度值明显高于M TT法和IN T法(图3),提示M TS/pms法检测白血病细胞增殖力较M TT法和IN T法更为灵敏。
并且由于M TS/pms经活细胞转化后没有结晶形式,直接溶于水,不需使用有机溶剂,因而也不会因为溶解的不彻底而影响检测结果。
・934・M TS/pms比色分析法检测白血病细胞增殖力T able 2 Specialities of MTS/pms ,MTTand INT colorimetric assaysType of assay Absorption peak of product measured (nm )Optimal concen 2tration of substrate (mg/ml )Form of product measuredMTT 490-580 2crystal IN T 490-510 1crystal MTS/pms490-510 2/5non 2crystal(aqueous soluble)Figure 3 MTS/pms colorimetric assay for H L 260cells andcomparison with MTT and INT assay.An experiment done in triplicate is presented讨 论活细胞转化四氮唑盐类的比色分析法(M TT 和IN T 法)是目前较为普遍使用的检测白血病细胞增殖力的方法。