DB21T 2742-2017 饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR 方法

ICS65.120

B 46 DB21 辽宁省地方标准

DB21/T 2742—2017

饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定

性检测方法PCR方法

Animal derived ingredients in Feed - qualitative detection of mink tissue derived

ingredients with PCR method

2017-02-23发布2017-03-23实施

前言

本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心提出。

本标准由辽宁省质量技术监督局归口。

本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。

本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、董娜。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法 1 范围

本标准规定了检测饲料中貂源组织成分的聚合酶链式反应检测方法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中貂源性成分的检测。

本方法的貂源性成分检测限为0.5 %（w/w）。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 14699.1 饲料 采样

GB/T19495转基因产品检测

GB/T 20195 动物饲料 试样的制备

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3 原理

利用氯仿抽提法或使用等效的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR产物用限制性内切酶酶切后电泳和测序进行确证。

4 试剂和材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂；实验用水为灭菌双重蒸馏水；所有实验室使用的试剂等级应为不含DNA和DNA酶的分析纯试剂，试剂的选购、验收、储存应符合规定。

4.1 引物

根据Primer 6软件设计，貂源性成分扩增产物为622bp，检测用引物（对）序列为：

F：5’- TTAGTAGCTCATAACGCCTTG -3’

R：5’- CGTGAGTATGTTCTTGGTTAG -3’

根据合成引物的标示浓度，用双重蒸馏水配制成10μM。

4.2 BstXⅠ限制性内切酶。

4.3 PCR Master mix（或DNA聚合酶、dNTP等PCR用试剂）。

4.4 基因组DNA提取试剂盒或其他替代试剂。

4.5 裂解缓冲液：250mmol/L SDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。

4.6 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0。

4.7 胶回收试剂盒或其他替代试剂。

4.8 电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。

4.9 琼脂糖：分子生物学级别。

4.10 溴化乙锭贮存液（10mg/mL）或荧光染料替代品。

4.11 DNA分子量标准品（100bp-1000bp）。

5 仪器设备

5.1 分析天平：感量为0.01g和0.0001g。

5.2 台式离心机：离心力12000r/min。

5.3 水浴锅：温度可调范围为28℃-95℃，误差为±0.5℃。

5.4 PCR仪。

5.5 电泳仪。

5.6 凝胶成像仪。

5.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（可测量微量样品）。

6 测定程序

饲料中貂源性成分测定程序见图1。

图1 饲料中貂源性成分测定程序图

7 操作步骤

7.1 制样

按GB/T 14699.1规定采集试样后，按GB/T 20195规定，取有代表性的样品1kg，四分法缩减，取约200g，经粉碎，全部过0.45mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。

7.2 模板提取

称取50mg试样于1.5mL离心管中，加入200μLTE，混匀；加入400μL裂解液，加400μL三氯甲烷，混匀；10 000r/min离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；10 000r/min离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μLTE，溶解沉淀。

也可采用等效的基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA。

7.3 核酸浓度及纯度检测

提取的DNA采用紫外分光光度计在260nm和280nm处检测其吸光值，紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2μg/mL-50μg/mL，OD值应在0.05-1.0区间内。1OD260=50μg/mL双链DNA，用水稀释，调整DNA浓度至20µg/mL。用于PCR反应的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.8，如低于1.8则重新进行DNA的提取。

7.4 PCR扩增

7.4.1 PCR反应体系

按表1的体系进行PCR反应液的配制。

表1 PCR反应体系

成分鉴定体系

PCR Master Mix 25μL

上游引物(10μM) 0.5μL

下游引物(10μM) 0.5μL

DNA模板100ng±50ng

ddH2O 调整体系体积至50μL

7.4.2 PCR扩增参数

按表2的条件进行PCR反应。

表2 PCR反应条件

反应预变性扩增延伸

循环数 1 30 1

温度/℃95 95 48 72 72

时间5min 30s 30s 45s 5min

7.4.3 质控样品

检测过程中分别设阳性对照和空白对照。

在貂源性成分的鉴定中，以貂肉粉末作为阳性对照。PCR过程中，以水作为空白对照。

7.4.4 PCR扩增产物电泳检测

取1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μl-10μL PCR扩增产物点样。9V/cm恒压电泳，直到指示剂迁移至凝胶尾部。凝胶成像仪下观察电泳结果并记录。

7.4.5 限制性内切酶酶切反应

酶切反应体系为20 µL，具体见表3，酶切条件根据说明书操作，电泳分析。

表3 酶切反应体系

成分体积/µL

10×Buffer 2

限制性内切酶BstXⅠ 2

PCR产物7

ddH2O 9

7.4.6 PCR扩增产物测序