DB21T 2742-2017 饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR 方法
雪貂检测报告
雪貂检测报告1范围本部分规定了实验用雪貂的微生物学等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定和检测结论等。
本部分适用于实验用雪貂的微生物学等级监测。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注8期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB14922.2实验动物微生物学等级及监测.GB/T 14926. 1实验动物沙门菌检测方法GB/T 14926. 4实验动物皮肤病原真菌检测方法GB/T14926.5实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法GB/T 14926. 6实验动物支气管鲍特杆菌检测方法GB/T 14926. 8实验动物支原体检测方法GB/T14926.13实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法GB/T14926.14实验动物金黄色葡萄球菌检测方法GB/T 14926. 15实验动物肺炎链球菌检测方法GB/T 14926. 16实验动物乙型溶血链球菌检测方法GB/T 14926. 16实验动物绿脓杆菌检测方法GB/T 14926. 47实验动物志贺菌检测方法GB/T 14926. 49实验动物空肠弯曲杆菌检测方法GB/T 14926. 56实验动物狂犬病病毒检测方法GB/T 14926. 57实验动物犬细小病毒检测方法GB/T 14926. 59实验动物犬瘟热病毒检测方法GB/T 27539 动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT- PCR检测方法NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法SN/T2552.8乳及乳制品卫生微生物学检验方法第8部分:普通变形杆菌和奇异变形杆菌检验SN/T2847水貂阿留申病检疫技术规范3术语和定义3.1实验用雪貂experimental ferret经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其他科学实验的雪貂。
2017年兽药残留标准制修订项目立项理由和主要技术要点.doc
1
788
修订《禽蛋、奶和奶粉中四环素、金 霉素、土霉素、多西环素残留量的测 定 高效液相色谱法》
2
789
修订《奶中双甲脒及其代谢物残留量 的测定 气相色谱法》
3
790
修订《水产品中激素类药物残留量的 测定 液相色谱-串联质谱法》
4
791
立项理由：原标准动物组织不全，检测限未达到检测要求 技术要点：1、能够替代 GB/T 22988-2008 2、批准使用的药物：红霉素、替米考星、泰乐菌素、泰万菌素、泰拉 菌素及有关代谢物 修订《奶及奶粉中大环内酯类药物残 未批准使用的药物：螺旋霉素、竹桃霉素、吡利霉素和阿奇霉素、罗 留量的测定 液相色谱-串联质谱法》 红霉素及有关代谢物 3、动物组织应包括：牛奶、羊奶、奶粉 4、定量限： 批准使用的药物：根据 MRL 指定 未批准使用的药物：1.0 以下 立项理由：原标准动物组织不全 技术要点：1、能够替代：农牧发[1998]17 号文 2、检测药物至少包括：非班太尔、芬苯达唑、奥芬达唑、奥苯达唑、 噻苯达唑、三氯苯达唑、阿苯达唑、氟苯哒唑、甲苯咪唑的残留标示 物 3、动物组织应包括：牛、羊、猪、鸡（肌肉、脂肪、肝、肾）、牛奶、 鸡蛋 4、定量限：50 以下
13
800
14
801
制定《氯氰菊酯在鱼组织中的最大残 留限量》
立项理由：该药物批准用于淡水鱼，缺少鱼组织最大残留限量 技5
802
制定《氯苯胍中在鱼组织中的最大残 留限量》
立项理由：该药物批准用于鱼，缺少鱼组织最大残留限量 技术要点：靶组织为鱼肌肉+皮。
16
803
制定《猪、鸡可食性组织中泰万菌素 残留量的测定 液相色谱—串联质谱 法》
23
810
饲料原料卫生标准2017
饲料原料卫生标准2017饲料原料卫生标准是指对于用于动物饲料加工过程中的原料的一系列卫生要求和规定。
通过严格执行饲料原料卫生标准，可以确保动物饲料的安全性和质量。
饲料原料卫生标准主要包括以下几个方面：1.原料来源要求：饲料原料必须来自合法、安全、可靠的渠道。
原料的生产地要具备良好的环境卫生条件，禁止使用有毒有害物质进行施药或者施肥。
2.原料质量要求：饲料原料必须符合国家标准或行业标准的相关规定，符合有关卫生安全的要求。
原料应该没有发霉、变质、变色、异味等异常情况，不得使用有害微生物或有害化学物质污染的原料。
3.原料运输和储存要求：饲料原料在运输过程中应严格控制环境温度和湿度，避免长时间暴露在阳光下。
原料的储存要具备良好的通风条件，防止潮湿和霉菌滋生。
4.饲料原料的处理要求：饲料原料在加工过程中，必须经过正确的清洗、消毒等处理措施，确保原料的卫生安全。
加工设备和加工场所也需要定期进行清洁和消毒。
5.饲料原料的标识和追溯要求：饲料原料必须正确标明原料的名称、产地、生产日期、保质期等信息。
同时，原料要有相应的追溯体系，以便在发生问题时进行追溯。
6.监测和检测要求：对于饲料原料的卫生状况，应进行定期的监测和检测。
监测内容包括对有毒有害物质残留、微生物污染、重金属含量等方面的检测。
通过严格执行饲料原料卫生标准，可以有效保障动物饲料的安全性和质量。
对于生产者而言，要严格按照标准要求购买和使用原料，确保原料的质量符合国家标准和行业规定。
对于监管部门而言，要定期进行抽检和检测，对于不符合标准的原料进行处罚，并加强对饲料加工过程的监管和检查。
而对于消费者而言，要选择合格的饲料产品，关注饲料的生产企业是否遵循卫生标准。
饲料原料卫生标准作为保障动物饲料安全的重要手段，对于动物生产的健康和发展具有至关重要的意义。
只有确保饲料原料的卫生安全，才能保障动物的健康，提高养殖业的发展水平，确保畜禽产品的质量和安全性。
因此，各方应共同努力，加强对饲料原料卫生标准的执行和监管，推动我国饲料产业的可持续发展。
动物源性饲料产品的卫生质量鉴定指标及其控制措施
ｗｅｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ］ ｆｅｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｓｏｕｒｃｅｓ； ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｇｉｅｎｅ ｑｕａｌｉｔｙ； ｉｎｄｅｘ； ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅ
动物源性饲料产品是指以动物或动物副产品 为原料， 经工业化加工制作的单一饲料。这类饲料 产 品 包 括 畜 禽 屠 宰 场 副 产 品 、水 产 制 品 、乳 制 品 、 蛋制品及其化工业（ 如蚕丝工业与制革工业） 副产 品等。动物源性饲料产品由于富含蛋白质和脂肪 而易于腐败和氧化酸败， 且极易受到微生物污染 和其他化学物质污染。因此， 对此类产品卫生质量 的鉴定和监控就显得十分重要。 １ 有关理化性质方面的卫生质量鉴定指标及其 控制措施 １．１ 水分 动物源性饲料产品的水分含量高， 会 直接影响产品的品质， 并影响到产品的贮存。产品 中水分含量过高时容易遭受微生物作用， 使蛋白 质腐败变质； 使产品中脂肪的酯键水解， 加速脂肪 酸败； 同时水分易使加工设备生锈， 而锈是脂肪酸 败的强力催化剂。因此， 水分是动物源性饲料产品 的必测指标， 其含量应限制在 １０ ％以下。我国有 关动物源性饲料产品的水分限量标准见表 １。
骨粉（ ＧＢ／Ｔ ２０１９３― ≤３
２００６）
一级品
≤５
肉骨粉（ ＧＢ／Ｔ ２０１９３
二级品
皮革和毛皮 化学试验 乙二醇醚类物质含量的测定-最新国标
皮革和毛皮化学试验乙二醇醚类物质含量的测定1 范围本文件规定了皮革和毛皮中乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、二乙二醇二甲醚、三乙二醇二甲醚等6种乙二醇醚类物质含量的检测方法。
本文件适用于各种类型的皮革、毛皮及其制品中6种乙二醇醚类物质含量的测定，亦适用于乙二醇单甲醚乙酸酯、乙二醇单乙醚乙酸酯2种物质含量的测定。
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GB/T 39364 皮革化学、物理、机械和色牢度试验取样部位QB/T 1267 毛皮化学、物理、机械和色牢度试验取样部位QB/T 1272 毛皮化学试验样品的准备QB/T 1273 毛皮化学试验挥发物的测定QB/T 2716 皮革化学试验样品的准备QB/T 2717 皮革化学试验挥发物的测定3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。
4 原理将皮革或毛皮试样剪碎，采用超声波辅助甲醇进行萃取，萃取液经滤膜过滤或固相萃取柱净化后，通过气相色谱-质谱仪（GC-MS）进行测定，外标法定量。
5 试剂和材料一般规定：除非另有规定，所用试剂均为分析纯。
甲醇,色谱纯。
无水硫酸镁（MgSO4）。
6种乙二醇醚类物质标准品，物质信息详见附录A。
乙二醇醚类物质标准储备溶液，浓度均为1000 mg/L，采用甲醇（5.2）配制。
乙二醇醚类物质标准工作溶液，准确移取适量的乙二醇醚类物质标准储备液（5.5），用甲醇（5.2）稀释至合适的浓度，供仪器分析使用。
仪器和设备 6分析天平，分度值为0.1 mg。
萃取瓶，50 mL，可密封。
超声波发生器，工作频率40 kHz。
移液器，1 mL～10 mL。
聚四氟乙烯或聚酰胺滤膜，孔径0.45μm。
中性氧化铝固相萃取小柱，如1 g/6 mL。
容量瓶，5 mL、10 mL。
貂产地检疫规程
ICS 65.020.99B41DB21 辽宁省地方标准DB 21/ TXX—2012貂产地检疫规程（报批稿）DB21/TXX—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由辽阳市动物卫生监督管理局提出。
本标准由辽阳市质量技术监督局归口。
本标准主要起草单位：辽阳市动物卫生监督管理局本标准起草人：李彬、董超、王克军、白恩吉、孙柏柱。
貂产地检疫规程1 范围本标准规定了貂产地检疫的要求、检疫对象、检疫程序、检疫结果处理、检疫记录和防护要求。
本标准适用于饲养的貂产地检疫。
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GB16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB16549 畜禽产地检疫规范中华人民共和国动物防疫法辽宁省无规定动物疫病区管理办法动物检疫管理办法（农业部2010年第6号令）3 要求3.1饲养场未发生相关动物疫情。
3.2免疫记录齐全，规定的免疫疫病在免疫有效期内。
3.3临床检查健康。
3.4本标准规定需进行实验室疫病检测的，检测结果合格。
4 检疫对象狂犬病、阿留申病、犬瘟热、水貂病毒性肠炎、冠状病毒性肠炎。
5 检疫程序5.1检疫申报饲养者在其饲养的貂离开饲养地之前，应向当地动物卫生监督机构申报检疫。
申报时间为种用提前15天，屠宰或继续饲养的提前3天，并提交检疫申报单。
5.2 检疫受理动物卫生监督机构在接到检疫申报后，根据当地相关动物疫情情况，决定是否予以受理。
受理的，应及时派出官方兽医到现场或到指定地点实施检疫；不予受理的，应说明理由。
5.3查验资料5.3.1应查验貂养殖场《动物防疫条件合格证》和养殖档案，了解生产、免疫、监测、诊疗、消毒、无害化处理等情况。
查验养殖场是否发生过相关疫病。
如果发生过疫病，是否按照有关规定处置。
5.3.2应查验个人饲养貂的免疫信息，确认规定的免疫疫病是否在免疫有效期内。
现行国家标准294项
106 GB/T 18969-2003
107 GB/T 18970-2003
108 GB/T 19164-2003 109 GB/T 19370-2003 110 GB/T 19371.1-2003 111 GB/T 19371.2-2007 112 GB/T 19372-2003 113 GB/T 19373-2003 114 GB/T 19422-2003 115 GB/T 19423-2003 116 GB/T 19424-2018 117 GB/T 19539-2004 118 GB/T 19540-2004 119 GB/T 19541-2017 120 GB/T 19542-2007 121 GB/T 19684-2005 122 GB/T 20189-2006 123 GB/T 20190-2006 124 GB/T 20191-2006 125 GB/T 20192-2006 126 GB/T 20193-2006 127 GB/T 20194-2018 128 GB/T 20195-2006 129 GB/T 20196-2006 130 GB/T 20363-2006 131 GB/T 20411-2006 132 GB/T 20715-2006 133 GB 20802-2017 134 GB/T 20803-2006 135 GB/T 20804-2006 136 GB/T 20805-2006 137 GB/T 20806-2006 138 GB/T 20807-2006 139 GB/T 21033-2007 140 GB 21034-2017 141 GB/T 21035-2007 142 GB/T 21036-2007
狐、貉、貂专用全价鲜配合饲料的生产和应用
后 健康 、 有序 地发 展 提 供 了饲 料物 质 基础 。这 一饲
料的生产会有广阔的应用开发前景， 应引起毛皮动 物饲料厂家和养殖场家的重视。
４ 特种经济动植物／０ ８期 ２１ １年
提高消化率 ； 干粉 自配料在饲喂时需加入 和新鲜不变质的谷物类饲料、 微量元素等添加饲料 化干料 ， ０ ０ 鱼 蛋、 直接绞制而成 的， 以品质必须保留原材料饲料的 约占其干 重的 １％ ２ ％的鲜 肉、 、 奶和 饲料 所
以提 高适 口性 和 满 足 其 营 养 需要 ； 别 饲 个 营养 成 分 和 新鲜 程度 ， 杂菌 污 染 的为 合格 品 。可 添 加 剂 ， 无 常 参 照 肉、 、 、 、 禽 副 产 品 、 米 、 粕 等 的 国 养 者 用 干粉 自配料 时为避 免 食 后 拉稀 ， 加 入 不 同 鱼 蛋 奶 畜 玉 豆 的抗 菌 素类 药物 ， 时 间使用 ， 出现 抗 药性 ， 长 易 一旦 家 品质检 验 标准进 行 检验 。 ５２ 冻存 要 求 ． 发病 ， 用 药 时奏 效慢 ； 粉 自配料 虽 便 于保 存 、 再 干 运 可 要 求冷 藏在一 ３ １℃的冷库 内， 质期 为 ４ ６ 输 和 使 用 ， 一旦 保 管 失误 极 易产 生霉 变 。全价 鲜 ２— ８ 保 ～ 个月。若库温在一 ５ １℃的冷库 内， 保质期明显缩 短， 配合饲 料 就没 有上 述这 些 问题 。 常温 保存 时间不 得超 过 ２ 时 。 ４小 综 上 所述 ， 全价 配 合饲 料 不仅 符 合 我 国传 统 鲜 饲 喂模 式 ， 养 者 易 于 接 受 ， 皮 动 物 有 较 好 的适 饲 毛 应 性 ， 且 它完 整 地 保 留 了原材 料 饲料 的营 养成 分 而 和生 物 活 性物 质 ， 全可 避 免 因某 些饲 料 品种 奇缺 完 而造 成 的营 养 不全 价 ， 营 养全 价 性远 远 超 出鲜 自 其 配料和 干 粉 自配料 。这 一饲料 的 问世 不仅 是毛 皮动 物饲 料 和饲 喂 模 式 的有 益革 命 ， 是 养殖 业 必然 规 也
Q_JHS 001-2017畜禽毛皮动物饲料
饲料标签 饲料卫生标准 饲料粉碎粒度测定 两层筛筛分法 饲料产品混合均匀度的测定 饲料中粗蛋白的测定方法 饲料中粗脂肪的测定 饲料中粗纤维的含量测定 过滤法 饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定 饲料中钙的测定 饲料中总磷的测定 分光光度法 饲料中粗灰分的测定 饲料中水溶性氯化物的测定 饲料中总砷的测定 饲料中铅的测定 原子吸收光谱法 饲料中汞的测定 饲料中镉的测定方法 饲料中氟的测定 离子选择性电极法 饲料中氰化物的测定 饲料中亚硝酸盐的测定 比色法 饲料中游离棉酚的测定方法 饲料中异硫氰酸酯的测定方法 饲料中铬的测定 饲料中恶唑烷硫酮的测定方法 饲料中六六六、滴滴涕的测定 饲料中沙门氏菌的检测方法
Q/JHS 001—2017
I
Q/JHS 001—2017
畜、禽、毛皮动物饲料
1 范围
本标准规定了产品分类，要求，试验方法，检验规则，饲料标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于以动植物蛋白原料为主，辅以矿物质饲料、维生素、微量元素等按一定比例加工而成 的畜、禽、毛皮动物浓缩饲料以及以动植物蛋白、能量原料为主，辅以矿物质饲料、维生素、微量元素 等按一定比例加工而成的畜、禽、毛皮动物配合饲料。
锦州禾兴饲料有限公司 发 布
前 言
本标准按照GB/T1.1-2009规定编写。 本标准于2017年09月10日发布，2017年10月10日实施。 本标准替代Q/JHS 001-2014。 本标准为锦州禾兴饲料有限公司提出并起草。 本标准由锦州禾兴饲料有限公司批准。 本标准主要起草人：李再兴、李铁良。
2
Q/JHS 001—2017 3.2.5 狐狸幼子期配合饲料、狐狸生长期配合饲料、狐狸冬毛期浓缩饲料、狐狸妊娠期配合饲料、 狐狸哺乳期配合饲料、貉幼子期配合饲料、貉生长期配合饲料、貉冬毛期配合饲料、貉妊娠期配合饲料、 貉哺乳期配合饲料、貂幼子期配合饲料、貂生长期配合饲料、貂冬毛期配合饲料、貂妊娠期配合饲料、 貂哺乳期配合饲料、毛皮动物通用配合饲料、狐貉开口期配合饲料。 3.2.6 兔生长育肥期、兔生长期、兔妊娠期、兔泌乳期。
饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定-最新国标
饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定1范围本文件描述了饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱测定方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和动物源性饲料原料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定。
本文件液相色谱-串联质谱法的检出限为2.5µg/kg、定量限为5.0µg/kg，高效液相色谱法的检出限为0.25mg/kg、定量限为0.50mg/kg。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。
4液相色谱-串联质谱法（仲裁法）4.1原理试样中的待测物在弱碱性条件下用乙酸乙酯提取、正己烷脱脂，经混合型强阳离子交换小柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
4.2试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
4.2.1水：GB/T6682，一级。
4.2.2甲醇：色谱纯。
4.2.3乙腈：色谱纯。
4.2.4甲酸：色谱纯。
4.2.5乙酸铵：色谱纯。
4.2.6氨水。
4.2.7乙酸乙酯。
4.2.8乙酸钠溶液（82g/L）：称取8.2g乙酸钠，用水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，混匀。
4.2.95%乙酸溶液：移取5mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水稀释、定容，混匀。
4.2.101%乙酸-乙腈溶液：移取1mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用乙腈（4.2.3）稀释、定容，混匀。
4.2.11乙腈-5%乙酸溶液：移取10mL乙腈（4.2.3）于100mL容量瓶中，用5%乙酸溶液（4.2.9）稀释、定容，混匀。
国家质量监督检验检疫总局关于加强皮革、毛皮及制品有害化学物质检测的通知
国家质量监督检验检疫总局关于加强皮革、毛皮及制品有害化学物质检测的通知文章属性•【制定机关】国家质量监督检验检疫总局(已撤销)•【公布日期】2008.04.08•【文号】国质检检函[2008]202号•【施行日期】2008.04.08•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】失效•【主题分类】正文国家质量监督检验检疫总局关于加强皮革、毛皮及制品有害化学物质检测的通知（2008年4月8日国质检检函[2008]202号）各直属检验检疫局：皮革、毛皮及其制品是我国传统出口产品，产量和出口量均占全球的70％左右。
为积极推行清洁生产工艺，保护环境，保障产品的安全质量，应对国外贸易技术壁垒，保证行业持续发展，我国制定了GB20400-2006《皮革和毛皮有害物质限量》标准。
该标准规定了皮革和毛皮及其制品中禁用偶氮染料、甲醛等有害物质的限量要求，并于2007年12月1日正式实施。
为了切实加强进出口皮革和毛皮制品禁用偶氮染料和游离甲醛的检验，现就有关要求通知如下：一、自通知下发之日起，各局对列入《出入境检验检疫机构实施检验检疫的进出境商品目录》中的所有进出口皮革、毛皮及其制品的检验应增加禁用偶氮染料、甲醛等两个项目，检验方法和判定指标按附件1规定执行。
经检验不合格产品不允许进出口。
二、皮革、毛皮及其制品现行各检验规程的主要起草单位应尽快完成检验规程修订工作，及时将上述标准及国外最新技术要求纳入检验规程。
三、为了及时掌握我国出口毛皮及其制品的安全质量情况，提高检验监管有效性，各主产地局立即开展辖区出口毛皮及制品安全质量的抽查检测工作，并于5月10日前将抽查检测结果报总局检验监管司。
其中，河北局、河南局、广东局和浙江局抽查检测批数不少于20批，并应涵盖GB 20400标准规定的A、B、C三类产品；山东局、江苏局、内蒙古局、辽宁局、吉林局、黑龙江局和四川局抽查检测批数不少于10批。
出口毛皮及其制品抽查检测范围见附件2。
狐貉貂常用动物源性饲料原料的主要营养指标
狐貉貂常用动物源性饲料原料的主要营养指标
佚名
【期刊名称】《饲料博览：技术版》
【年(卷),期】2007()2
【摘要】水貂、狐狸为肉食动物，貉子为杂食动物，从而决定了他们的食物取向，多数以动物源性饲料为主，植物饲料为辅。
动物源性饲料主要来源为水产品、畜禽肉及其副产品、乳、蛋类及毛皮动物胴体。
常用动物源性饲料主要营养指标见表1。
【总页数】1页(P55-55)
【关键词】动物源性饲料;营养指标;饲料原料;狐貉;水貂;肉食动物;植物饲料;毛皮动物
【正文语种】中文
【中图分类】S816.48
【相关文献】
1.我国珍贵毛皮动物(貂、狐、貉)饲料营养研究进展 [J], 高秀华;吴学壮;张铁涛
2.狐貉貂配种期主要饲养管理/狐貉貂常用动物源性饲料原料的主要营养指标 [J], 刘世茂
3.狐、貉、貂常用药物及用药方法 [J], 林洁
4.貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因的遗传多样性分析 [J], 王君玮;姜平;王志亮;张维;李林;赵永刚
5.狐、貉、貂常用饲料的加工与调制 [J], 华树芳;华盛
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ICS65.120B 46 DB21 辽宁省地方标准DB21/T 2742—2017饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法Animal derived ingredients in Feed - qualitative detection of mink tissue derivedingredients with PCR method2017-02-23发布2017-03-23实施前言本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。
本标准由辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心提出。
本标准由辽宁省质量技术监督局归口。
本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。
本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、董娜。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
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饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法 1 范围本标准规定了检测饲料中貂源组织成分的聚合酶链式反应检测方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中貂源性成分的检测。
本方法的貂源性成分检测限为0.5 %（w/w）。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1 饲料 采样GB/T19495转基因产品检测GB/T 20195 动物饲料 试样的制备SN/T1193基因检验实验室技术要求3 原理利用氯仿抽提法或使用等效的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR产物用限制性内切酶酶切后电泳和测序进行确证。
4 试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂；实验用水为灭菌双重蒸馏水；所有实验室使用的试剂等级应为不含DNA和DNA酶的分析纯试剂，试剂的选购、验收、储存应符合规定。
4.1 引物根据Primer 6软件设计，貂源性成分扩增产物为622bp，检测用引物（对）序列为：F：5’- TTAGTAGCTCATAACGCCTTG -3’R：5’- CGTGAGTATGTTCTTGGTTAG -3’根据合成引物的标示浓度，用双重蒸馏水配制成10μM。
4.2 BstXⅠ限制性内切酶。
4.3 PCR Master mix（或DNA聚合酶、dNTP等PCR用试剂）。
4.4 基因组DNA提取试剂盒或其他替代试剂。
4.5 裂解缓冲液：250mmol/L SDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。
4.6 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0。
4.7 胶回收试剂盒或其他替代试剂。
4.8 电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。
4.9 琼脂糖：分子生物学级别。
4.10 溴化乙锭贮存液（10mg/mL）或荧光染料替代品。
4.11 DNA分子量标准品（100bp-1000bp）。
5 仪器设备5.1 分析天平：感量为0.01g和0.0001g。
5.2 台式离心机：离心力12000r/min。
5.3 水浴锅：温度可调范围为28℃-95℃，误差为±0.5℃。
5.4 PCR仪。
5.5 电泳仪。
5.6 凝胶成像仪。
5.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（可测量微量样品）。
6 测定程序饲料中貂源性成分测定程序见图1。
图1 饲料中貂源性成分测定程序图7 操作步骤7.1 制样按GB/T 14699.1规定采集试样后，按GB/T 20195规定，取有代表性的样品1kg，四分法缩减，取约200g，经粉碎，全部过0.45mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。
7.2 模板提取称取50mg试样于1.5mL离心管中，加入200μLTE，混匀；加入400μL裂解液，加400μL三氯甲烷，混匀；10 000r/min离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；10 000r/min离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μLTE，溶解沉淀。
也可采用等效的基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA。
7.3 核酸浓度及纯度检测提取的DNA采用紫外分光光度计在260nm和280nm处检测其吸光值，紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2μg/mL-50μg/mL，OD值应在0.05-1.0区间内。
1OD260=50μg/mL双链DNA，用水稀释，调整DNA浓度至20µg/mL。
用于PCR反应的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.8，如低于1.8则重新进行DNA的提取。
7.4 PCR扩增7.4.1 PCR反应体系按表1的体系进行PCR反应液的配制。
表1 PCR反应体系成分鉴定体系PCR Master Mix 25μL上游引物(10μM) 0.5μL下游引物(10μM) 0.5μLDNA模板100ng±50ngddH2O 调整体系体积至50μL7.4.2 PCR扩增参数按表2的条件进行PCR反应。
表2 PCR反应条件反应预变性扩增延伸循环数 1 30 1温度/℃95 95 48 72 72时间5min 30s 30s 45s 5min7.4.3 质控样品检测过程中分别设阳性对照和空白对照。
在貂源性成分的鉴定中，以貂肉粉末作为阳性对照。
PCR过程中，以水作为空白对照。
7.4.4 PCR扩增产物电泳检测取1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。
在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。
将5μl-10μL PCR扩增产物点样。
9V/cm恒压电泳，直到指示剂迁移至凝胶尾部。
凝胶成像仪下观察电泳结果并记录。
7.4.5 限制性内切酶酶切反应酶切反应体系为20 µL，具体见表3，酶切条件根据说明书操作，电泳分析。
表3 酶切反应体系成分体积/µL10×Buffer 2限制性内切酶BstXⅠ 2PCR产物7ddH2O 97.4.6 PCR扩增产物测序7.4.6.1 PCR扩增产物回收采用经验证的胶回收试剂盒进行电泳后的PCR目的片段回收，按照试剂盒使用说明书回收DNA。
7.4.6.2 PCR扩增产物测序将特异性条带进行琼脂糖凝胶回收，纯化并委托测序，测序结果见附录A。
7.5 结果表述7.5.1 PCR扩增产物电泳检测结果貂源性成分扩增产物为622bp，序列参考附录A，图谱见附录B。
貂源性成分的PCR产物被BstXⅠ酶切为107bp和515bp两个片段，图谱见附录B。
7.5.2 结果判定PCR产物为阳性，同时酶切结果符合附录B、测序结果同源性达到99%判为含有貂源性成分，表述为检出貂源性成分；PCR产物为阴性者，不需要再进行酶切和测序鉴定，判为不含有貂源性成分，表述为未检出貂源性成分。
8 检测过程中防止交叉污染的措施参考GB/T 19495.2《操作过程中避免交叉感染》和SN/T1193《基因检验实验室技术要求》执行。
附 录 A（资料性附录）貂源性成分PCR产物测序结果CAGTGATAAAAATTAAGCCATGAACGAAAGTTTGACTAAGCCATGTTAACACCAAGAGTTGGTA AATTTCGTGCCAGCCACCGCGGTCATACGATTAACCCAAATCAATGGGCCAACGGCGTAAAACG TGTTAAGGACTATACAACACTAAAGTTAAAATTTAACCAGGCCGTAAAAAGCTACTGTTAATACA AAACAAACCACGAAAGTGACTTTACCACTTCCGACAACACGATAGCTGAGATCCAAACTGGGAT TAGATACCCCACTATGCTCAGCCCTAAACATAAATAATTCACATAACAAAATTACTTGCCAGAGA ATGTTAAAGCAATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCTCTAGAGGAGCCT GTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCACTTCTAGCTAAATCAGTCTATATACCGCCA TCTTCAGCAAACCCTTAAAAAGGAAGAAAAGTAAGCACAATAATGATACATAAAAAAGTTAGGT CAAGGTGTAACCCAGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTAACCAAGAAAATACTCACA附 录 B（资料性附录）貂源性成分扩增产物及酶切凝胶电泳图图B.1貂源性成分扩增产物及酶切凝胶电泳图（LaneM：DL1000；Lane1：貂源性成分的扩增产物；Lane2-3：貂源性成分PCR产物酶切结果）_________________________________。