【CN109868321A】鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒【专利】
应用多重实时荧光PCR方法对8种动物毛纤维种类鉴别的研究
应用多重实时荧光PCR方法对8种动物毛纤维种类鉴别的研究刘艳艳;范阳阳;步迅;胡悦;东野升金;谭晴晴;张全芳【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2018(049)007【摘要】本研究旨在利用多重实时荧光PCR方法对水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维进行物种鉴定研究.利用碱裂解法加入二硫苏糖醇,并结合硅珠吸附核酸法来优化动物毛纤维DNA的提取;根据8种动物16S rDNA基因特异核苷酸序列设计通用PCR引物和特异性TaqMan荧光探针;通过优化引物和探针浓度及退火温度等PCR反应体系和条件,建立了多重实时荧光PCR检测体系;并对多重PCR体系的特异性、灵敏度、重复性和适用性进行评估.结果表明,使用SDS-二硫苏糖醇DTT-蛋白酶K结合Chelex-100法,并利用硅珠纯化提取动物毛纤维DNA效果最佳,满足实时荧光PCR检测要求.本方法DNA灵敏度为0.01 ng,混合样本方法检出限为1.0％.因此本方法能够从动物毛纤维提取高质量DNA,建立的多重实时荧光PCR检测体系具有特异性强、重复性好和灵敏度高等优势.本方法可用于水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物及其混合物毛纤维的鉴定,为拓展动物毛纤维在物种识别、分子进化研究、分子标记辅助育种和遗传资源评价等领域中的应用奠定基础.【总页数】10页(P1540-1549)【作者】刘艳艳;范阳阳;步迅;胡悦;东野升金;谭晴晴;张全芳【作者单位】山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室,济南250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室,济南250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室,济南250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室,济南250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室,济南250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室,济南250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省农业科学院应用生命科学实验室,济南250100【正文语种】中文【中图分类】Q341【相关文献】1.应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒 [J], 郑夔;丁国允;周惠琼;谢雪妹;李小波;师永霞;苏锦坤;黄吉城2.动物源性成分鉴别的样品制备方法研究——应用于PCR及荧光定量PCR方法的样品制备 [J], 李洁;陆仲斐;童锐;李向伟;周凌3.化妆品中动物源性成分多重实时荧光 PCR检测方法的研究 [J], 刘艳艳;霍胜楠;梁水美;卞如如;张卉;步迅4.小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立及在部分啮齿类动物的应用 [J], 王吉;岳秉飞;贺争鸣;王莎莎;付瑞;王淑菁;李威;秦骁;黄宗文;李晓波;巩薇5.多重实时荧光定量PCR方法在高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测中的应用[J], 王晓明;戴卫健;余道军;刘宏钱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物产品中牛、羊源性成分多重PCR检测方法的建立
动物产品中牛、羊源性成分多重PCR检测方法的建立
邵碧英;陈文炳;郑腾;江树勋;张志灯;李寿崧
【期刊名称】《畜牧与兽医》
【年(卷),期】2004(36)3
【摘要】以肉骨粉、鱼粉、猪肉干和鱼肉干为研究对象,异硫氰酸胍法提取总DNA,18S rDNA片段的扩增结果表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质。
应用梯度PCR技术对牛、羊源性成分检测的退火温度进行了优化,在单一PCR检测技术的基础上分别进行了18S rDNA片段和牛、羊源性成分的多重PCR分析,得到了预期的结果。
试验表明,本文建立的多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,对动物产品牛、羊源性成分检测具有重要意义。
【总页数】3页(P7-9)
【关键词】动物产品;牛源性成分;羊源性成分;多重PCR;检测方法;动物性食品安全;饲料安全
【作者】邵碧英;陈文炳;郑腾;江树勋;张志灯;李寿崧
【作者单位】福建出入境检验检疫局
【正文语种】中文
【中图分类】S859.84
【相关文献】
1.动物产品中猪源性和牛源性成分双重荧光PCR检测方法的建立 [J], 赵冉
2.应用多重PCR同时检测牛、羊源性成分 [J], 宗卉;范万红;温燕辉
3.动物油脂中DNA的提取及牛、羊源性成分的PCR检测 [J], 邵碧英;张体银;李志方;郑腾;陈文炳
4.饲料与动物产品中牛、羊源性成分的多重PCR检测 [J], 邵碧英;陈文炳;杨婕
5.动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化 [J], 邵碧英;张体银;杨婕;陈文炳;郑腾
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动物荧光定量PCR检测方法
动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒一、实验前准备（一）、分装反应液（以鸡鸭源为例）１、将反应液（GA）与Bst聚合酶离心15s，取出，在反应液中加入Bst聚合酶全部加入到反应液（GA）中离心15s，将其分装小管中，每个管分23µL。
一般分到24-26个。
2、分装完毕，取密封液加入每个小管中各一滴（所取密封液的枪一定要竖直加入）。
3、全部完毕后将其和试剂盒放到-20℃冰箱中保存。
:注：①每一种试剂盒中，出来反应液与对应的阳性对照不可混用外，其他三种均可通用。
②每一试剂盒中都有反应液、Bst聚合酶、密封液、阴阳对照五种试剂。
（二）、试验中试剂的准备1、Proteinase K：加入600µL Protease Dissolve Buffer至Proteinase K管子中，颠倒混匀使蛋白酶K充分溶解，保存于-20℃。
2、Buffer GW1：加入14mL无水乙醇。
3、Buffer GW2：加入40mL无水乙醇。
注：每一种试剂盒上都有相应的说明。
Buffer GW1和Buffer GW2加入无水乙醇的量按说明书操作。
二、动物组织DNA提取1、取30-100µL Buffer AE（这是一个样品的量，具体量取决于自己做的实验样品的个数），于70℃中预热，备用。
2、取1-20mg的样品，将其剪切成尽量小的碎片，转移到1.5mL的离心管中。
加入230µL Buffer MTL和20µL Proteinase K，涡旋混匀。
55℃水浴1-3h（具体时间看样品的消化情况）。
水浴期间要时常将样品涡旋混匀。
注意：取样量不可以太多，过多会降低产量与纯度。
脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA，不宜超过10mg。
肌肉和皮肤可相应增加到30mg。
3、加入5µL RNase Solution（RNA裂解酶）（枪身不要碰着RNase Solution）至消化液中，涡旋混匀。
多重PCR 法检测5 种动物源性成分的适用性验证
食品科技多重PCR法检测5种动物源性成分的适用性验证马慧娟，高 宏*，牛鹏飞，梅 婵(江苏省理化测试中心，江苏南京 210042)摘 要：为了探索新建立的一种多重PCR对动物源性食品检测的适用性，实验采用猪、牛、羊、鸡和鸭肉混合的方法，用多重PCR对混合肉样进行检测，以验证多重PCR的检测的可行性和有效性。
通过对市售20种样品提取DNA进行多重PCR 和单一PCR的5种动物源性成分检测结果比对，进一步比较两种方法检测结果的不同。
结果表明，建立的多重PCR可同时检测出2种、3种、4种和5种动物源性成分，采用多重PCR法和单一PCR法对20种市售样品分别检测，两种方法结果无差异，表明所建立的多重PCR法可检测猪、牛、羊、鸡和鸭5种动物源性成分。
关键词：动物源性食品；多重PCR；单一PCR；适用性应用PCR方法检测食品中动物源性成分的研究和标准有很多，目前已颁布的国家标准、行业标准和地方标准主要是基于常规定性PCR法和实时荧光PCR法对单一动物源性成分的定性检测。
在实际工作中，对于动物源性成分不明确的加工制品，在需明确其成分时，需要通过不同的方法进行多次检测才能确定结果，其周期长、工作量大、成本高。
在未来的动物源成分检测中，基于常规定性PCR法的检测技术已经越来越不能满足多种动物源性制品的鉴定需求，因此建立多重PCR法提高检测的效率与通量对肉类食品安全的及时监管十分重要[1]。
本研究通过对新建立的一种检测动物源性食品中猪、牛、羊、鸡和鸭成分的多重PCR法进行混合肉样检测，验证其方法的适用性和可行性，并用建立的多重PCR检测方法和单一PCR检测方法对市售的20种动物源性食品分别进行检测，验证多重PCR法鉴别猪、牛、羊、鸡和鸭成分可行性。
1 材料与方法1.1 材料及试剂鲜肉（猪、牛、羊、鸭、鸡）购自南京某大型菜市场，-20 ℃保存。
加工肉制品（鸭血、牛肉卷、鸡肉火腿肠、午餐肉罐头等）购自南京某菜市场、超市或火锅食材店。
鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用[发明专利]
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专利名称：鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：曾少灵,秦智锋,花群义,阮周曦,卢体康,曹琛福,陈书琨,吕建强,张彩虹,孙洁,陈兵
申请号：CN200910094768.9
申请日：20090727
公开号：CN101659996A
公开日：
20100303
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种能同时鉴别三种反刍动物品种的生物检测试剂，以及这种试剂的制备方法和应用。
本发明是选择牛、山羊和绵羊特异和保守的线粒体基因保守序列片段为靶目标，应用Primer Express 3.0软件和DNAStar中的Primer Select软件，设计合成多组引物和探针。
将设计的多对引物和探针合成和标记后进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针组合。
本发明所述的试剂包含两对特异性引物和三条Taq Man探针，其中，一对引物针对牛源性成分，另一对是针对山羊和绵羊源性成分检测的通用引物，三条探针分别针对牛、山羊和绵羊源性成分，对牛、山羊和绵羊源性成分检测的扩增目标片段长度分别为92bp、136bp和136bp。
本发明中的三重Taq Man荧光PCR检测方法可同时对牛、山羊和绵羊源性成分进行准确的定性检测，操作简便，结果直观，特异性强，灵敏度高，重复性好，可实现多种源性成分的高通量检测。
申请人：花群义
地址：518010 广东省深圳市罗湖区和平路2049号和平大厦检验楼702室
国籍：CN
代理机构：云南派特律师事务所
代理人：张怡
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【CN109868321A】鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910257118.5(22)申请日 2019.04.01(71)申请人 陕西科技大学地址 710021 陕西省西安市未央区大学园1号(72)发明人 徐秦峰 澹台玮 马西亚 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任公司 61200代理人 范巍(51)Int.Cl.C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒：提取样品中的DNA作为模板，利用设计的多对物种特异性引物，进行多重PCR扩增，对多重PCR扩增的产物进行高分辨熔解曲线分析，根据扩增产物熔解峰的位置判别样品中所含的动物源性成分。
本发明操作简单、检测周期短、特异性强、检测结果可靠，可以避免开管造成污染问题以及实现大规模样品的检测。
权利要求书2页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 109868321 A 2019.06.11C N 109868321A1.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，设计用于扩增对应动物种类的基因组中某段特异性序列的扩增引物；2)对步骤1)设计的针对不同动物种类的扩增引物进行多重PCR扩增及扩增产物熔解的特异性检验；3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的针对不同动物种类的特异性扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，将该高分辨熔解曲线与以各动物种类基因组DNA为模板并采用所述特异性扩增引物扩增得到的对应产物的高分辨熔解曲线进行比对，根据比对匹配的熔解峰位置确定所述样品中动物源性成分的构成情况。
饲料中六种动物源性成分多重PCR快速检测方法
饲料中六种动物源性成分多重PCR快速检测方法
刘煊;郑文杰;赵卫东;贺艳;刘辉;何晨光
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2009(030)003
【摘要】采用试剂盒对含有牛、羊、猪等6种动物源性成分饲料中的DNA进行提取,根据动物线粒体DNA序列设计引物.以18 s rRNA作为内源基因对照,对DNA提取产物进行6种动物源性成分多重PCR扩增,同时对6种动物源性成分进行特异性鉴定.结果分别扩增出6种动物的特异性条带,证明该多重PER方法具有较高的特异性和灵敏度.
【总页数】4页(P141-144)
【作者】刘煊;郑文杰;赵卫东;贺艳;刘辉;何晨光
【作者单位】天津出入境检验检疫局,天津300201;天津出入境检验检疫局,天津300201;天津出入境检验检疫局,天津300201;天津出入境检验检疫局,天津300201;天津出入境检验检疫局,天津300201;天津出入境检验检疫局,天津300201
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.食品接触材料中沙门氏菌的多重PCR检测方法 [J], 赵琢;栗建永;贾晓川;李晶;王华;柳明
2.化妆品中动物源性成分多重实时荧光 PCR检测方法的研究 [J], 刘艳艳;霍胜楠;梁水美;卞如如;张卉;步迅
3.鸡六种病毒多重PCR检测方法的建立和应用 [J], 吴静;赵润鹏;徐雪维;王婉;杨小康;胡东
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910257118.5
(22)申请日 2019.04.01
(71)申请人 陕西科技大学
地址 710021 陕西省西安市未央区大学园1
号
(72)发明人 徐秦峰 澹台玮 马西亚
(74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任
公司 61200
代理人 范巍
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6888(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试
剂盒
(57)摘要
本发明公开了一种鉴别动物源性成分的多
重荧光PCR方法及试剂盒：提取样品中的DNA作为
模板，利用设计的多对物种特异性引物，进行多
重PCR扩增，对多重PCR扩增的产物进行高分辨熔
解曲线分析，根据扩增产物熔解峰的位置判别样
品中所含的动物源性成分。
本发明操作简单、检
测周期短、特异性强、检测结果可靠，可以避免开
管造成污染问题以及实现大规模样品的检测。
权利要求书2页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 109868321 A 2019.06.11
C N 109868321
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109868321 A
1.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，设计用于扩增对应动物种类的基因组中某段特异性序列的扩增引物；
2)对步骤1)设计的针对不同动物种类的扩增引物进行多重PCR扩增及扩增产物熔解的特异性检验；
3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的针对不同动物种类的特异性扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，将该高分辨熔解曲线与以各动物种类基因组DNA为模板并采用所述特异性扩增引物扩增得到的对应产物的高分辨熔解曲线进行比对，根据比对匹配的熔解峰位置确定所述样品中动物源性成分的构成情况。
2.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤1)中，扩增引物扩增的目的片段在200bp以下，扩增的目的片段位于对应动物种类基因组的特异性保守区域，不同动物种类对应的扩增产物在长度和/或GC比值上存在区别。
3.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，经过检验确定的特异性扩增引物选自针对山羊的引物对P1、针对绵羊的引物对P2、针对牛的引物对P3、针对水牛的引物对P4中的两对以上引物；其中，引物对P1的序列为：上游引物：5'-GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCCACCAAAATTCAACACAATAC CACAT-3'
下游引物：5'-GCGGGCGCCGCCCTGCCCGCAGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'引物对P2的序列为：
上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'
下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'
引物对P3的序列为：
上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'
下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'
引物对P4的序列为：
上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3'
下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。
4.根据权利要求3所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述多重PCR扩增的反应体系包括DNA模板、引物对P1、P2、P3和P4、PCR反应试剂、双蒸水以及荧光染料。
5.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述高分辨熔解的程序为：将多重PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始逐渐升温至95℃，同时连续检测荧光强度。
6.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述样品采集自乳制品或生乳。
7.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括针对不同动物种类的特异性扩增引物、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品对应的高分辨熔解曲线。
8.根据权利要求7所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所
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