【CN109868321A】鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910257118.5

(22)申请日 2019.04.01

(71)申请人 陕西科技大学

地址 710021 陕西省西安市未央区大学园1

号

(72)发明人 徐秦峰　澹台玮　马西亚　

(74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任

公司 61200

代理人 范巍

(51)Int.Cl.

C12Q 1/6888(2018.01)

C12Q 1/686(2018.01)

C12N 15/11(2006.01)

(54)发明名称

鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试

剂盒

(57)摘要

本发明公开了一种鉴别动物源性成分的多

重荧光PCR方法及试剂盒：提取样品中的DNA作为

模板，利用设计的多对物种特异性引物，进行多

重PCR扩增，对多重PCR扩增的产物进行高分辨熔

解曲线分析，根据扩增产物熔解峰的位置判别样

品中所含的动物源性成分。本发明操作简单、检

测周期短、特异性强、检测结果可靠，可以避免开

管造成污染问题以及实现大规模样品的检测。

权利要求书2页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 109868321 A 2019.06.11

C N 109868321

A

权　利　要　求　书1/2页CN 109868321 A

1.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，设计用于扩增对应动物种类的基因组中某段特异性序列的扩增引物；

2)对步骤1)设计的针对不同动物种类的扩增引物进行多重PCR扩增及扩增产物熔解的特异性检验；

3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的针对不同动物种类的特异性扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，将该高分辨熔解曲线与以各动物种类基因组DNA为模板并采用所述特异性扩增引物扩增得到的对应产物的高分辨熔解曲线进行比对，根据比对匹配的熔解峰位置确定所述样品中动物源性成分的构成情况。

2.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤1)中，扩增引物扩增的目的片段在200bp以下，扩增的目的片段位于对应动物种类基因组的特异性保守区域，不同动物种类对应的扩增产物在长度和/或GC比值上存在区别。

3.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，经过检验确定的特异性扩增引物选自针对山羊的引物对P1、针对绵羊的引物对P2、针对牛的引物对P3、针对水牛的引物对P4中的两对以上引物；其中，引物对P1的序列为：上游引物：5'-GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCCACCAAAATTCAACACAATAC CACAT-3'

下游引物：5'-GCGGGCGCCGCCCTGCCCGCAGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'引物对P2的序列为：

上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'

下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'

引物对P3的序列为：

上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'

下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'

引物对P4的序列为：

上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3'

下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。

4.根据权利要求3所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述多重PCR扩增的反应体系包括DNA模板、引物对P1、P2、P3和P4、PCR反应试剂、双蒸水以及荧光染料。

5.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述高分辨熔解的程序为：将多重PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始逐渐升温至95℃，同时连续检测荧光强度。

6.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述样品采集自乳制品或生乳。

7.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括针对不同动物种类的特异性扩增引物、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品对应的高分辨熔解曲线。

8.根据权利要求7所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所

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