耐高温柠檬酸菌种驯化及筛选
发酵工厂菌种选育的具体方法与实验设计[1]
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发酵工厂菌种选育的具体方法与实验设计[1]食品发酵与酿造工艺学题目：发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计年级：xxxx级专业：食品科学与工程姓名：xxx学号：xxxxxxx柠檬酸的菌种选育的具体方法与实验设计微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。
而自然界现有的菌种由于其产量较低，不能直接用于生产，目前，发酵工业生产中所使用的菌种，都是经过人工选育的优良菌种。
本篇以柠檬酸的菌种选育为例，阐述发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计。
柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性能、化学性能、衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸。
我国的柠檬酸产业，较早地进入了国际市场，经过多年的努力和奋斗已成为世界第一的生产和出口大国。
特别是经历了近几年的竞争与整合，全行业的面貌大为改观。
所以柠檬酸的菌种选育对于整个行业和国家来说都尤为重要。
一．柠檬酸的菌种的具体选育方法1.取样：从腐烂水果上分离出一株柠檬酸产生菌——黑曲霉。
2.培养基的制备：2.1 分离培养基(%)：甘薯粉15%，柠檬酸l0%分装在试管内，1公斤/厘米2压力灭菌20分钟。
2.2 生长培养基：4°Be’麦芽汁，2%琼脂。
l公斤/厘米2压力灭菌15分钟。
2.3 种子培养基(%)：甘薯粉8%，献皮l%。
每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米2压力灭菌30分钟。
2.4 发酵培养基：12%甘薯粉，每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米2压力灭菌30分钟。
3.菌种培养方法：采用迥转摇床，193转/分，偏心距25毫米，31℃振荡培养，菌丝接种，接种量5%(v/v)，培养5天。
4.菌种的分离与筛选：采用酸性滤纸法，把少许试样混入分离培养基中，摇匀，倾入无菌培养皿内(内有2—3层滤纸做支持物)，31℃培养4—5天，把长出的单菌落挑入生长培养基斜面上，31℃培养4—5天，即可见到抱子。
柠檬酸高产菌株选育
柠檬酸高产菌株的选育222011********* 刘亚超 2011级生物技术关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。
为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。
目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。
本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。
引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。
柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。
所以可以起抗凝血作用。
柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。
所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。
1.材料与方法1.1 材料1.1.1菌种以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。
1.1.2培养基分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。
1.1.3 试剂及仪器3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。
1.2 方法1.2.1 菌株的分离纯化用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。
1.2.2 初筛用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。
取各个不同梯度的孢子悬液1 mL注人2％淀粉查氏培养基平板中涂布，28℃，培养3 d-KI试剂，测量菌落产生的透明圈大小并记录下数据。
原生质体融合选育耐高温柠檬酸生产菌
ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ １ １ ８ ． ７ Ｌ ａ ｃ ｉ ｄ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｔ ４ ０ ℃ ｆ ｏ ｒ ７ ２ ｈ ．Ｔ ｈ ｅ ａ ｃ ｉ ｄ ｙ ｉ ｅ ｌ ｄ ｏ ｆ ｓ ｔ ａ ｉ ｎ Ｒ５ ０ ２ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｅ ｄ
Ａｂｓ ｔ ｒ ａｃ ｔ ： Ｔｏ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｈ ｉ ｇ ｈ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｃ ｉｔ ｒ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｐｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ， ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｔ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ— ｙ ｉ ｅ ｌ ｄ
摘
要： 为 获得 耐 高 温柠 檬 酸 生 产 菌 ， 利 用 原 生 质 体 融 合技 术将 具 有优 良性 状 的 高 产 菌 株 Ｗ 和 耐 高 温 柠 檬 酸 生 产
茵 Ｙ一７ １ １ 进行 融合 ， 筛选耐 高温的高产柠檬 酸生产茵。通过 变色圈筛选得 到融合株 Ｒ ５ ０ ２ ， 在４ ０ ｃ Ｃ培养 ７ ２ ｈ就可
第 １ ３ 卷第 ５ 期
２ ０ １ ５ 年 ９月 生物加工过程
Ｖ ｏ １ ． １ ３ Ｎｏ ． ５
Ｓｅ ｐ． ２ ０１ ５
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｉｎ ｒ ｇ
中 图分 类 号 ： Ｑ ７ ８ ４ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ ２ — ３ ６ ７ ８ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ５ — ０ ０ ２ ６ — ０ ５
Ｈｉ ｇ ｈ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕｒ ｅ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎｔ ｃ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｐ ｒ ｏ ｄｕ ｃ ｉ ｎ ｇ
一株耐高温柠檬酸生产菌株[发明专利]
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专利名称：一株耐高温柠檬酸生产菌株专利类型：发明专利
发明人：黄和,李霜,左静,徐晴,满云
申请号：CN201110360406.7
申请日：20111115
公开号：CN102352322A
公开日：
20120215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物工程技术领域，涉及一株耐高温柠檬酸生产菌株。
本发明还涉及获得该菌株的诱变筛选方法及应用方法。
本发明的菌株分类命名为zjs-8，保藏号为CCTCCNO：M2011359。
得到该菌株的方法是采用离子束注入诱变处理出发菌株，然后将处理后的菌液涂布于含溴甲酚绿的筛选平板上高温培养，挑取变色圈与菌落直径比值较大的单菌落进行高温发酵产柠檬酸。
采用此方法筛选得到的菌株可耐受42℃的高温，且在高温条件下遗传性状稳定，产酸水平较高，这对柠檬酸工业的节能生产提供了一条可行的道路。
申请人：南京工业大学
地址：210009 江苏省南京市新模范马路5号南京科技广场A座1309室
国籍：CN
代理机构：江苏致邦律师事务所
代理人：樊文红
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柠檬酸发酵微生物
• 3.真空冷冻干燥保藏法（广泛采用的方法）
• 简称冻干法； • 通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子 悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结， 并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完 全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造 成无氧真空环境，最后 • 置于低温下，使微生物 • 处于休眠状态，而得以 • 长期保藏。 • 使孢子始终处于低温、 • 干燥、缺氧的条件下。 • （1~10年）
• 4.液氮超低温（-196 ℃ ）保藏法
• 以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温 （-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞 从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内 的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水 凝结成冰晶而使细胞损伤。 • 适用于菌种的长期保存，-196 ℃远远低于微生物新 陈代谢作用停止温度（-130 ℃ ），此时菌体代谢 活动已停止。
2.黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征
• ①能耐高浓度柠檬酸（15%以上），而不利用和分 解柠檬酸。 • ②耐高浓度葡萄糖（18-20%）；能产生和分泌大量 的酸性α -淀粉酶和酸性糖化酶，糖化酶最适作用 pH在4.0~4.6，最适温度为60~65 ℃。
• ③能利用淀粉质、糖蜜、葡萄糖母液等原料 发酵生产柠檬酸。
（二）柠檬酸生产菌的诱变育种
诱变育种： 在人为地条件下,利用物理,化学等因素, 诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和 微生物地新品种，进而设法从大量的变异群 体中筛选出优良的突变株的过程。
• 诱变剂-能提高菌种突变率的物质。 • 物理诱变剂：UV、氮离子注入、x射线等（染色体 水平上导致突变） • 化学诱变剂：（导致更细微的基因水平的突变） • 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS甲基磺酸乙酯、 DES硫酸二乙酯 • 亚硝基烷基化合物：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚 硝基-N-乙基脲烷（NEU） • 亚硝酸（改变核酸结构和性质） • 叠氮化钠（可获得较高的突变频率）、环氧乙烷、 吖啶橙等。
降解柠檬酸的酵母菌的筛选及降酸特性研究--hu
降解柠檬酸的酵母菌的筛选及降酸特性研究一、研究内容和意义摘要柠檬酸是柑橘等水果中的主要有机酸，在果汁、果酒生产中是影响其风味和口感的主要物质，由于一些水果中柠檬酸含量过高而影响了果汁、果酒的口感。
本项目拟筛选一株降解果汁中柠檬酸的酵母菌，通过生物降解的方法来适度降低这些果汁中的含量偏高的柠檬酸。
本项目的研究对进行工业化生产获得风味和口感俱佳的果汁、果酒具有现实意义。
二、主题词柠檬酸；酵母菌；选育；降酸三、立论依据（包括项目的研究意义及国内外现状分析）果酒的生产是利用新鲜的水果为原料，利用野生的或人工添加酵母菌来分解糖分，产生酒精及其他副产物。
伴随着酒精和副产物的产生，果酒内部发生一系列复杂的生化反应，最终赋予果酒独特的风味及色泽。
在生产中为了达到酿造高质量的果酒。
果酒中的酸有原料带来的，如葡萄中的酒石酸，苹果中的苹果酸，杨梅中的柠檬酸等；也有发酵过程中产生的，如醋酸，丁酸，乳酸，琥珀酸等。
酒中含酸量如果适当，酒的滋味就醇厚、协调、适口。
反之则差。
同时，酸对防止杂菌的繁殖也有一定的作用。
生产中用于表示果酒含酸量的指标有总酸和挥发酸。
总酸，即成酸性反应的物质总含量，与果酒的风味有很大关系（果酒一般总酸量为0.5-0.8克／100毫升）。
挥发酸，是指随着水蒸气蒸发的一些酸类，实践中以醋酸计算（果酒中的挥发酸不得高于0.15克/100毫升）。
适量的有机酸可以赋予果酒醇厚感和清爽感，可以抑制病菌的活动，另外酸还可以溶解色素物质，使果酒的颜色更加美丽，所以说有机酸是影响果酒感官特性的重要指标之一。
本项目侧重适度降低这些果酒、果汁中含量偏高的柠檬酸。
通常的降酸方法包括化学降酸法和生物降酸法。
化学降酸是在果汁或酒液中加入化学试剂(如碳酸钙、碳酸氢钾、酒石酸钾和双钙盐等)，其操作简单易行，降酸效果明显，但其化学反应往往会影响口感和酒液的色泽，同时由于金属离子的大量溶入，可能会带来酒液的不稳定，如失光、混浊等。
这些化学试剂一般为弱酸盐．它们与酒样中的强酸盐发生化学反应，置换出强酸，从而达到降酸的目的。
产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选
产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选一、实验目的1.了解和掌握柠檬酸发酵菌种黑曲霉的菌种特性和分离方法。
2.初步掌握菌种筛选方法设计。
二、实验原理柠檬酸主要用于食品工业，作为酸味料广泛用于饮料、果酱、水果糖、冰淇淋等，还用于制药、化工、塑料等工业。
能用于生产柠檬酸的菌种有毛霉、青霉、曲霉，其中尤以黑曲霉产生柠檬酸的能力最强，且能利用多种碳源，是生产中最常见的菌种。
黑曲霉广泛存在于自然环境中，空气、水、土壤中都有该菌存在。
本实验根据野生柠檬酸发酵菌种耐酸性的特点，从土壤中分离纯化以获得柠檬酸发酵的野生菌种。
三、仪器与试剂高压灭菌锅、恒温培养箱、干燥箱、超净工作台、恒温摇床、培养皿、三角瓶、烧杯、接种棒、试管、量筒、滤纸、酒精灯等。
四、方法与步骤指示剂法（变色圈法）（一）菌种分离平板采用察氏-多氏琼脂培养基加入0.04%溴甲酚绿：蔗糖30g NaNO3 2g MgSO4·7H2O 0.5gKH2PO4 1g KCl O.5g FeSO4·7H2O 0.01g溴甲酚绿0.4g 琼脂20g 蒸馏水1000ml PH自然。
土壤浸出液稀释以后，涂在上述培养基制成的平板上，于30℃培养。
由于产酸，菌落周围会出现黄色变色圈。
在变色圈还未互相连成一片时，测量变色圈直径（C）与菌落直径（H）之比。
取C/H比例较大者，并且具有黑曲霉特征的菌落挑出接到斜面上（点接法，点接在斜面中部偏下方），筛选时要考虑菌种耐高温、抗杂菌污染及原料。
（二）初筛一般初筛培养基可进行如下选择和设计（1）薯干粉直接发酵：25%薯干粉蒸煮后，用液化型淀粉酶（如枯草杆菌淀粉酶）液化，升温灭酶灭菌后，加入α-萘粉1mg/1或氯化十六烷基吡啶胺1mg/1.（2）水解糖发酵：水解糖稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO32g/1,MgSO4·7H2O O.5g/1，一氟乙酸钠50mg/1。
（3）葡萄糖母液发酵：母液稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO31～2g/1，一氟乙酸钠50mg/1。
耐热酶菌株的筛选及高温培养时的适应机制研究
耐热酶菌株的筛选及高温培养时的适应机制研究随着全球气候的变化和人类活动的加速，环境中对生物的温度要求越来越高。
在这种情况下，研究和利用耐热酶菌株的意义变得越来越重要。
耐热酶菌株可以在高温的情况下进行生化反应，具有重要的产业应用价值。
本文将从耐热酶菌株的筛选和高温培养的适应机制两个方面进行探讨。
一、耐热酶菌株的筛选耐热酶菌株的筛选一般是通过在高温环境下筛选具有生物活性的微生物来实现的。
这个过程需要有高温环境条件和适当的培养基。
在这个基础上，通过使用一系列的鉴定方法，比如酶活性鉴定、形态学鉴定、分子生物学鉴定等方式，从中筛选出适合产业利用的耐热酶菌株。
例如，糖化酶和聚合酶等制药和食品加工领域中常用的酶，需要在高温条件下稳定地表达，所以从环境样品中筛选出能够高效并稳定表达这些酶的耐热酶菌株，对于生产和质量保证具有非常重要的意义。
二、高温培养时的适应机制研究生物在不同的温度下生活和生长，其适应机制有所不同。
在高温环境下培养的耐热酶菌株，可能形成了一套生理适应机制，以应对高温环境下的生存和生长。
一般而言，高温环境下导致蛋白质和核酸的结构变化，从而导致这些生物分子无法正常地表达和产生生物活性。
而耐热酶菌株需要克服这些障碍，通过特殊的适应机制来保证自身的生长和繁殖。
研究表明，耐热酶菌株中存在大量螺旋形、伸展型、超长主链等具有特殊结构的蛋白质，这些蛋白质具有更高的耐温性和生物催化活性。
此外，在高温下，耐热酶菌株的细胞膜中富含高不饱和度的脂肪酸和胆固醇，这些组分具有保护细胞膜完整性的作用。
另外，耐热酶菌株的细胞壁结构也发生改变，增加了多糖和蛋白质的含量，从而维持细胞壁的完整性和稳定性。
同时，耐热酶菌株还可以利用某些耐受热性蛋白质的辅助作用，增加细胞内的抗氧化物质含量，保证生物体内氧化还原平衡状态，从而维持生物体内的正常代谢功能。
综上，耐热酶菌株的筛选和高温培养时的适应机制研究，是生物技术与产业应用领域中的热点问题，相关的研究工作具有非常重要的科学价值和实际意义。
耐高温耐高酸柠檬酸菌种驯化及筛选
耐高温耐高酸柠檬酸菌种驯化及筛选【摘要】：选取发酵良好的出发菌株，通过高温和高酸驯化及筛选，得到2株耐37℃高温、耐高酸30%、发酵性能优于原柠檬酸菌种Co827黑曲霉。
【关键词】：柠檬酸黑曲霉；耐高温高酸菌株；筛选【abstract 】: the fermentation of good start strains, through the high temperature and high acid domestication and screening, get two strains 37 ℃high temperature resistance, resistance to high acid 30% better performance than the original citric acid, fermentation Co827 aspergillus species.【keywords 】: citric acid aspergillus; High temperature resistant strains of the high acid; screening前言：柠檬酸是一种用途广泛对环境没有任何破坏作用的无色晶体，在食品和饮料工业中作为调味剂、保鲜剂、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂。
为了提高菌种在高酸环境下酶的活性，需要对菌种进行耐高酸驯化。
柠檬酸深层通风发酵工艺在夏季高温季节，要控温在30℃-33℃，需采取一系列降温措施，为减少降温带来的麻烦和费用，采用耐高温柠檬酸发酵是行之有效的措施之一。
以黑曲霉Co827为出发菌种，从37℃高温发酵液中分离菌种，经酸性驯化优筛得到2株耐高温高酸、产酸高、转化率高的优良菌株。
1材料与方法1.1材料1.1.1样品高温发酵液分离出的菌株1.1.2培养基富集驯化培养基：80BX-150BX麦芽汁100ml，pH值自然，0.1MPa灭菌25min-30min;分离培养基：50BX-80BX麦芽汁100ml，琼脂2g，30%柠檬酸，0.1MPa，灭菌25min-30min，制成平板备用；摇瓶培养基：按参考文献[2]方法配制。
耐高温乳酸菌的分离与鉴定
耐高温乳酸菌的分离与鉴定耐高温乳酸菌的分离与鉴定耐高温乳酸菌的分离与鉴定【1】【摘要】目的：本实验从不同地方采集的青贮玉米饲料、果渣、牛奶、新鲜的泡菜汁等样品中筛选耐高温乳酸菌。
方法：通过初筛、复筛，获得一株耐高温且产酸能力较强的菌株L1;依据伯杰氏系统细菌学手册和乳酸菌分类鉴定的标准和描述，对其进行了生理生化特性鉴定;通过单因素试验和正交试验确定菌株L1的最佳发酵条件。
结果：确定其为乳杆菌属德氏乳杆菌;最佳增殖培养基组分为：玉米粉16%+麸皮5%;在α-淀粉酶(5 U/g玉米粉、90 ℃、30 min)和糖化酶(150 U/g玉米粉、55 ℃、2 h～3 h)酶解作用下，最佳发酵条件为：发酵温度60 ℃，发酵时间36 h，pH值3.5。
结论：经过初筛、复筛获得一株耐高温菌株L1，通过糖发酵等生理生化试验、正交试验鉴定，最后确定此菌株为乳杆菌属德氏乳杆菌(LacotobaciLLus deLbbruecki)。
【关键词】耐高温乳酸菌;分离;鉴定乳酸菌(Lactobacillus)是一类能从可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)产生大量乳酸的细菌的统称[1]。
由于乳酸菌具有糖利用率高、发酵液中纯度高、副产物少，使其在乳酸工业中占有重要地位[2]。
乳酸菌在食品发酵、青贮饲料、堆肥生产、医药行业等众多领域有着广泛的应用研究[3，4]，而在众多固态发酵领域中一个难以解决的问题是固态发酵中高温迅速产生对乳酸菌的杀灭作用，因而选育耐高温菌株具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。
本研究从青贮饲料、果渣、泡菜、牛奶中分离高温乳酸菌，并对其发酵条件的优化进行了初步研究。
1 材料与方法1.1 实验材料乳酸菌：从上海光明乳业金山牧场提供的青贮玉米饲料、陕西海盛果汁厂提供的果渣、山东牟平安得利果汁厂提供的果渣、西安农贸市场购得的新鲜泡菜汁、上海光明乳业提供的牛奶中进行分离，将收集的样品带回实验室置于4 ℃冰箱保存备用。
标准菌株：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbbruecki) JCM 1022、嗜酸乳杆菌(Lacidophilus) ATCC 3456、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IFO 13957,由陕西微生物研究所提供。
耐60度高温乳酸菌的驯化及鉴定
METCHNIKOFF(俄国 )在 1907年最先发现了乳 酸菌能增强机体免疫力 , 从而引起了广泛的关注 。 在 肠道的正常菌群中 , 乳酸菌为优势菌群 , 能与肠黏膜 紧密结合 , 阻止食物抗原 、病毒 、细菌的进入 , 从而维 持肠道内微生态平衡 [ 1] 。 乳酸菌在畜 牧业 、食品 加 工业 、医药行业等领域应用广泛 [ 2] , 但现阶段的一个 难题是发酵中迅速产生的高温对其生长的抑制以及 巴氏消毒法对乳酸菌的杀灭作用 。而目前国际上通 用的低温巴氏消毒法是将牛奶加热到 60 ～ 65 ℃, 保 持 30 min。 因此对耐 60 ℃高温乳酸菌的选育有利于 解决巴氏消毒和发酵过程中存在的问题 。
中国微生态学杂志 2011年 4月第 23卷第 4期
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产酸产气培养基 , 葡萄糖和葡萄糖酸盐 , 碳水化合物 发酵产酸试验培养基 , 甲醇试验 (V-P试验 )培养基等 均为市购商品培养基 。 1.3 染料 革兰结晶紫 , 碘液 , 沙黄 。 1.4 仪器 多功能显微镜 BL-410, 日本奥林巴斯公 司 ;恒温培养箱 HH.B11, 上海跃进医疗器械厂 ;原子 力显 微 镜 SPI3800N-SPA400, 日 本 精 工 公 司 , 应 用 AFM的气相模式 , 100 μm Scanner, 其参数为 :X:115 μm、Y:115 μm、Z:29.97 μm, 表示应用的 Scanner在 X轴 、Y轴方向上的扫描移动范围最大值为 115 μm, 在 Z轴方向上移动范围最大值为 29.97 μm, Triangle 200 nm的 cantilever。 1.5 耐 60 ℃高温乳酸菌的驯化过程 将乳酸杆菌 接种于改良的 MRS液体培养基中 37 ℃培养至对数 生长期 , 即培养 24 h后转移至 45 ℃环境中继续培养 24 h, 又转种于 MRS液体培养基中 , 45 ℃环境 中培 养 , 同时用 MRS固体培养基计数其存活率 。 45 ℃环 境中反复传代 5 ～ 10代 , 使其连续 2 ～ 3代的存活率 达到 90%以上时 , 就将其环境 温度提升 5 ℃, 直 至 60 ℃。其中经历的温度为 37、45、50、55和 60 ℃。 1.6 耐 60 ℃高温驯化后的乳酸菌的鉴定 1.6.1 定性测定 ———纸层析法 以 1.5%乳酸为标 准溶液对驯化前后的乳酸菌发酵液进行纸层析实验 , 即将发酵菌液稀释至原浓度的 10-1 ～ 10-5 , 用 滴管 将 1滴稀释菌液点在纸上 , 重复点样几次 , 每次点之 前吹干 。展开剂为乙醇︰浓氨水︰水 =80︰ 5︰ 15 (体积比 );以 0.04%的溴甲酚绿酒精溶液为显色剂 , 待层析液挥发之后 , 向层析滤纸喷洒显色剂 , 测定菌 液移动的距离 。 并计算 Rf值 , Rf值 =Rf发酵 菌液 移动
柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选
微生物上游技术综合实验报告书（2013‐2014学年）实验题目：柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选学院名称：生物与化学工程学院柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选前言：柠檬酸(也称构椽酸)是重要的有机酸,是柠檬、袖子、柑橘、葡萄等水果天然酸味的主要成分。
天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。
柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。
柠檬酸发酵生产目前所采用的菌种主要是黑曲霉菌种和酵母菌菌种，而淀粉质原料发酵主要以黑曲霉菌种为主。
对于柠檬酸发酵行业来说，菌种产酸水平的高低是决定柠檬酸发酵生产的关键因素之一，因此，柠檬酸菌种黑曲霉的选育研究一直成为科研人员关注的焦点，国内外有很多关于柠檬酸发酵菌种黑曲霉选育的研究报道。
我国柠檬酸生产菌种的发酵水平经过几十年的努力，工业产酸水平平均达到13%以上，尽管我国柠檬酸发酵技术在世界上暂时处于领先地位，但菌种选育方面的竞争依然形势严峻。
因此，应当加快产柠檬酸产生菌的研究，继续筛选高产柠檬酸的优良菌株，扩大产柠檬酸菌种的来源。
本实验主要进行了土壤中柠檬酸高产菌株黑曲霉的筛选、形态、产酶条件及酶学性质的研究。
黑曲霉（Aspergillus niger）的形态特征和生理特征。
在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。
孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。
菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端生成串分生孢子。
黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。
黑曲霉生长最适pH 值因菌种而异，一般pH 值为3～7；产酸最适pH 值为1.8～2.5。
生长最适（optimum ）温度为33～36℃，产酸最适温度在28～36℃，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在35°Be 左右的麦芽汁培养基上。
耐热微生物的筛选及其酶类产物的制备
耐热微生物的筛选及其酶类产物的制备热稳定酶是指在高温条件下能够保持活性的酶类，相比于常规酶类，其具有极高的价值和应用前景。
然而，由于微生物体内的大部分酶类都是无法在高温下稳定的，所以一直以来，人们都在寻找能够在高温条件下保持酶活性的微生物。
这就涉及到耐热微生物的筛选及其酶类产物的制备。
一、耐热微生物筛选方法耐热微生物的筛选需要在高温条件下进行，一般采用以下方法：1. 高温筛选法这种方法是常见的筛选方法之一。
将土壤样品或其他环境样品放到高温条件下，比如80~85摄氏度的温度。
耐受高温的微生物会迅速生长并繁殖，这样就可以筛选出耐高温微生物了。
2. 压力筛选法这种方法是在高压条件下筛选出耐热微生物的。
因为在高压环境中，水的气化点会升高，微生物体内的生理代谢也会随之改变，从而可以筛选出耐受高压的微生物。
3. 电子射线筛选法在这种方法中，将微生物样品暴露在电子束线下，通过破坏微生物体内的细胞结构，从而使耐受电子束辐射的微生物更容易生长繁殖，这样就可以筛选出耐受高温，高压和电子束辐射的耐热微生物了。
二、耐热酶的制备方法1. 蛋白质重组技术蛋白质重组技术是制备耐温酶的最常见方法之一。
这种方法通过基因工程技术将耐热微生物中的酶基因转移到其他微生物的载体中，再通过大量培养和纯化技术获得高纯度的耐热酶。
2. 纳米技术纳米技术在耐热酶的制备中也起到了重要作用。
通过固定耐热酶在纳米颗粒上，能够提高酶的稳定性和活性，并且也能避免酶在反应过程中的失活或过度降解。
3. 常规酶的改造通过对一些常规酶进行改造，可以增加酶的稳定性和活性。
比如，将酶的活性中心与其他蛋白质结合，或者将酶的分子结构改造成更紧密和更稳定的结构。
三、耐热酶的应用前景1. 在农业领域中的应用耐热酶可以在作物育种等方面发挥重要作用。
比如，在种植作物的过程中，耐热酶可以用于借助含铜酰氨基酸药剂对作物进行保护，以提高一些庄稼植株的收成及对气候变化的适应性。
2. 在医药领域中的应用耐热酶在医药领域中有很多应用。
耐热微生物的筛选及其应用研究
耐热微生物的筛选及其应用研究【前言】随着生物技术的发展，微生物的应用越来越广泛。
其中，耐热微生物的筛选及其应用研究日益受到关注。
本文将阐述耐热微生物的筛选方法、鉴定手段以及在食品加工、医药工业等领域的应用。
【一、耐热微生物的筛选方法】1.1 利用温度作为筛选条件温度是微生物生长的重要条件之一，也是筛选耐热菌的一种常规方法。
以极端嗜热微生物为例，其生长温度一般在60℃以上，可利用不同温度条件筛选出嗜热菌并进行进一步鉴定。
1.2 利用抗热剂的筛选方法利用抗热剂可以筛选出对热稳定剂具有耐受性的微生物。
例如，在大豆固体培养基中添加抗氧化剂可选出一系列具有抗氧化剂耐受性的腐败细菌。
1.3 利用胁迫筛选法通过在混合菌中引入特定条件胁迫（如缺失特定营养物质或添加毒素等）可以筛选出能够适应并生长的耐热微生物。
【二、耐热微生物的鉴定手段】2.1 形态学鉴定利用显微镜观察耐热微生物的形态特性，如细胞形态、染色情况、孢子形态等。
2.2 生理生化鉴定利用耐热微生物在不同条件下的生理生化反应特性，如对不同营养源的利用情况、酶活性等。
2.3 分子鉴定通过分子生物学技术，如PCR和测序技术，鉴定目标微生物的DNA序列，从而确定微生物在分类学上的位置。
【三、耐热微生物在食品加工中的应用】3.1 酸奶发酵耐热乳酸菌是酸奶制作中的重要菌种，它们能够在较高温度下生存、生长和发酵。
可通过筛选耐热菌种并培养、利用其酸奶发酵能力满足市场需求。
3.2 肉制品加工在肉制品加工中，耐热乳酸菌和耐热芽孢杆菌常被应用于腌制和发酵过程中，以提高产品品质，并延长产品保质期。
【四、耐热微生物在医疗领域的应用】4.1 发酵制备药物利用耐热微生物进行发酵可制备多种生物大分子药物。
如耐热菌E. Coli BL21(DE3)可用于表达和生产复杂蛋白质。
4.2 消毒剂耐热芽孢菌在制造消毒产品中应用广泛。
它们能够在高温条件下生存，灭活时也不容易被破坏或失活，是制造高效消毒剂的理想菌株。
柠檬酸高温发酵菌种选育及应用研究
柠檬酸高温发酵菌种选育及应用研究
魏炜;杨明贤
【期刊名称】《山东食品发酵》
【年(卷),期】1999(000)002
【摘要】我们以黑曲霉Asp. niger5016为出发菌株,经U. V照射,高温处理、Co^(60)-γ射线辐射、NTG复合处理诱变,筛选出一株耐高温菌,在39℃发酵摇瓶60h,产酸达13.8%,转化率达98.6%。
比亲株5016在相同温度(39℃)下,提高产酸48%以上,经分析杂酸很少,纯度大于97%以上;大罐发酵,其发酵温度39—40℃,发酵周期54—60h,产酸转化率达99%,其产品纯度为99.9%。
【总页数】9页(P7-15)
【作者】魏炜;杨明贤
【作者单位】沈阳建工学院;沈阳建工学院
【正文语种】中文
【中图分类】TQ921.1
【相关文献】
1.糖蜜原料深层发酵生产柠檬酸的研究——菌种选育 [J], 邬敏辰
2.柠檬酸菌种选育研究进展 [J], 刘林明;王燕;杨平平;卢德彦;左金磊
3.利用马铃薯渣和黑淀粉发酵柠檬酸的菌种选育 [J], 杨庆文;孙文敬;谢红;赵峰梅;郭金权;王慕华
4.碱性果胶酶菌种选育及在纺织前处理中的应用研究 [J], 吴茜;沈雪亮;汪钊
5.食用菌菌种选育中酯酶同工酶的应用研究 [J], 杨立红;黄清荣;辛晓林;王淑芳;蔡德华;鞠艳丽
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洗后装入５００ｍＬ三角瓶中，０．１ＭＰａ 灭菌３０ｍｉｎ￣４５ｍｉｎ。 １．２ 方法 １．２．１ 测定方法
总糖和还原糖测定：按文献 ［３］的方法进行。 柠檬酸的酸度测定及转化率计算 ［３］：柠檬酸的酸度 测定是取发酵滤液１ｍＬ，酚酞为指示剂，０．１４２９ｍｏｌ／Ｌ￣ ０．１４３０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ滴定，所消耗ＮａＯＨ的毫升数即为酸 度产酸率。
Ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＭＡ Ｌｉ－ａｎ， ＨＥ Ｆｅｉ－ｙｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｃｈｉｎａ）
２００７ Ｎｏ．１１
·５８· Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１７６
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅｓ
取分离样品１ｍＬ，接种于富集驯化培养基中，在３５℃、 ２００ ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养４８ｈ，再取培养液１ｍＬ进行传代 驯化。每４８ｈ接种传代１次。经过若干代高温驯化后，选 择生长代谢旺盛、菌丝球丰富而小、分布均匀者供平板 分离初筛。 １．２．５ 平板分离初筛
将复筛得到的麸曲孢子分别接于摇瓶培养基中，以 原菌种作为对照（ＣＫ），每株３个重复，总糖０．１２ｋｇ／ｋｇ，在 ３５℃、２００ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养７２ｈ，测酸度计算转化率。 ２ 结果与分析 ２．１ 初筛与复筛结果
经过高温驯化、平板分离初筛，共选出５５株菌接种 于斜面上，再经复筛得到耐高温且产酸率均高于对照 （ＣＫ）的８株柠檬酸菌进行发酵试验，结果见表１。
选取沙市柠檬酸厂夏季发酵良好的高温发酵液 ５００ ｍＬ作为分离样品；Ｃｏ８２７ 黑曲霉由上海微生物研 究所提供。 １．１．２ 培养基
富集驯化培养基：８°Ｂｘ￣１５°Ｂｘ麦芽汁１００ｍＬ，ｐＨ值自
然，０．１ＭＰａ灭菌２５ｍｉｎ￣３０ｍｉｎ； 分 离 培 养 基 ：５°Ｂｘ￣８°Ｂｘ 麦 芽 汁 １００ｍＬ，琼 脂 ２ｇ，
３ 结论 筛选出的耐高温柠檬酸菌株Ｔ５０和Ｔ５２号，在薯干醪
液中于３５℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养时产酸率和转化率均高于对 照黑曲霉Ｃｏ８２７，且转化率更接近理论转化值；同时发酵 周期缩短了２４ｈ，可减少柠檬酸通风搅拌发酵的费用。
参考文献：
［１］ 东玉武，孙建梅，王景明． 柠檬酸的应用与开发 ［Ｊ］． 天津化工， ２００３，１７（５）：３３－３４．
表１ 摇瓶发酵试验复筛结果 Ｔａｂｌｅ １． Ｓ ｅｃｏｎｄａｒｙ ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂｙ ｓ ｈａｋｅ ｆｌａｓ ｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
表２ 复筛的黑曲霉麸曲孢子生长状态 Ｔａｂｌｅ ２． Ｇｒｏｗｔｈ ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓ ｐｏｒｅｓ ｏｎ ｂｒａｎ
［５］ 王电垒，马应伦，于瑞琪． 耐高温醋酸菌分离与筛选的试验研 究 ［Ｊ］． 中国酿造，１９９８（２）：１８－１９．
［２］ 马立安，贺飞英． 耐高酸柠檬酸高产菌种的驯化及筛选 ［Ｊ］． 湖 北农学院学报，２００２，２４（２）：１１７－１１８．
［３］ 王福源． 现代食品发酵技术 ［Ｍ］． 北京：中国轻工业出版社， １９９８：２２８－２３４．
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柠檬酸是一种用途广泛对环境没有任何破坏作用 的无色晶体，在食品和饮料工业中作为调味剂、保鲜剂、 防腐剂、抗氧化剂、增稠剂。柠檬酸深层通风发酵工艺 在夏季高温季节，要温度控制在３０℃￣３３℃，需采取一系 列降温措施，为减少降温所带来的麻烦和费用，采用耐 高温柠檬酸菌发酵是行之有效的措施之一。
以黑曲霉Ｃｏ８２７为出发菌种，从３３℃高温薯干醪柠 檬酸发酵液中分离菌种，经优筛得到２株耐高温、产酸 高、转化率高的优良菌株，为保障夏季柠檬酸生产的正 常进行提供了基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 样品
ｍｅｄｉｕｍ ｄｕｒｉｎｇ ｓ ｅｃｏｎｄａｒｙ ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ
菌株号
Ｔ１ Ｔ１０ Ｔ２３ Ｔ３２ Ｔ４１ Ｔ５０ Ｔ５２ Ｔ５５ ＣＫ
麸曲孢子生长的状态
菌丝生长较快，孢子数量较多，颜色有点发黄 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长较快，孢子黑，数量较多 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长较快，孢子黑，数量较多 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长快，孢子数量多，但颜色微黄 菌丝生长较慢，孢子黑，但数量较少
表３ 摇瓶优选结果 Ｔａｂｌｅ ３． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓ ｕｌｔｓ ｂｙ ｓ ｈａｋｅ ｆｌａｓ ｋ ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ
菌株号 产酸率／％ 转化率／％
Ｔ１０－１ １２．０ １００．３ Ｔ１０－２ １２．０ Ｔ１０－３ １２．１ Ｔ３２－１ １２．１ １００．６ Ｔ３２－２ １２．１ Ｔ３２－３ １２．０ Ｔ５０－１ １２．３ １０２．８ Ｔ５０－２ １２．３ Ｔ５０－３ １２．４
柠檬酸转化率＝（总酸／总糖）×１００％
１．２．２ 实验流程［４－５］
样品采集→富集驯化→平板初筛→斜面纯化→摇瓶复筛→ 麸曲孢子→摇瓶优筛→获得耐高温、产酸高的柠檬酸菌株
１．２．３ 柠檬酸菌种的耐温驯化［４－５］
收稿日期： ２００７－０５－２９ 基金项目： 长江大学科研发展基金（ＨＮＺＤ２００２１２） 作者简介： 马立安（１９６４－ ），女，湖北人，副教授，主要从事食品微生物、微生物分子生物学研究工作。
蘸取驯化柠檬酸菌液于分离平板上划线，３５℃培 养２４ｈ￣４８ｈ，挑选生长优良的单菌落接种于斜面试管中。 １．２．６ 摇瓶复筛
将初筛得到的菌株分别接种于摇瓶培养基中进行 摇瓶测酸，以原菌种作对照（ＣＫ），每株１瓶，总糖０．１３ｋｇ／ｋｇ， 在３５℃、２００ ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养７２ｈ （还原糖≤０．５％）， 每２４ｈ测１次酸度，淘汰产酸较低的菌株，将产酸较高的 菌株接种于麸曲扩大培养基中，３５℃培养制成麸曲孢子。 １．２．７ 摇瓶优筛
经验交流
中国酿造
２００７ 年 第 １１ 期
总第 １７６ 期 ·５７·
耐高温柠檬酸菌种驯化及筛选
马立安， 贺飞英
（ 长江大学 生命科学学院， 湖北 荆州 ４３４０２５）
摘 要： 选取发酵良好的高温（３３℃）薯干醪柠檬酸发酵液，通过温度驯化与筛选，得到２株优良菌种，耐３５℃高温、发酵产酸性能优于 原柠檬酸菌种Ｃｏ８２７ 黑曲霉。 关 键 词： 柠檬酸黑曲霉；耐高温菌株；筛选 中图分类号： ＴＳ ２０１．３ 文献标识码： Ｂ 文章编号： ２０５４－ ０５７１（ ２００７） １１－ ００５７－ ０２
菌株号 产酸率／％ 转化率／％
Ｔ５２－１ １２．４ １０３．１
Ｔ５２－２ １２．４
Ｔ５２－３ １２．３
ＣＫ－１ １０．９
９０．３
ＣＫ－２ １０．８
ＣＫ－３ １０．８
菌株号
Ｔ１ Ｔ１０ Ｔ２３ Ｔ３２ Ｔ４１ Ｔ５０ Ｔ５２ Ｔ５５ ＣＫ
不同时间产酸率／％
２４ｈ
４８ｈ
７２ｈ
４．９
９．０
１１．３
４．８
８．８
１１．５
４．８
９．２
１１．３
５．１
９．３
１１．２
５．１
９．５
１１．３
Байду номын сангаас
５．１
９．９
１１．９
５．２
１０．０
１２．１
５．０
９．３
１１．８
４．６
８．９
１１．０
２．２ 优筛结果 Ｔ１０、Ｔ３２、Ｔ５０和Ｔ５２菌株的麸曲孢子在３５℃高温培
养条件下长势优于ＣＫ（表２）；在３５℃高温发酵７２ｈ产酸率 及转化率也均高于ＣＫ，但Ｔ５０和Ｔ５２的转化率更接近理 论转化率１０６％（表３），即Ｔ５０和Ｔ５２为所得２个优良菌株。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ－ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｒｏｔｈ ａｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ， ｔｗｏ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ ａｔ ３３℃ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ｂｏｔｈ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ａｔ ３５℃ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｍｏｒｅ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｈａｎ ｔｈｅｉｒ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ Ａ． ｎｉｇｅｒ Ｃｏ８２７． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ； ｈｉｇｈ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ