研究真核生物启动子结构与功能的方法

研究真核生物启动子结构与功能的方法

研究启动子结构与功能的方法主要有缺失、点突变和足迹法。在分析得到了启动子的功能序列后，还要弄清与之结合的蛋白质及两者间的相互作用。在研究真核生物启动子的结构与功能时，常采用下列方法。

（1）卵细胞系统（oocyte system）该方法是将DNA直接注射人爪蟾卵细胞的细胞核，分析和观察RNA的转录情况。该方法的局限性在于试验条件受卵细胞内条件的限制。可以用来分析：DNA片段的特性，不能用于分析蛋白质因子与DNA间的结合。

（2）转染系统（transfection system）将外源DNA导人转染的细胞并使之表达。表达可分为瞬时表达（transient expression）和整合表达（integrant expression）。由于转录是在细胞内完成的，可以看成是一种体内试验系统。但外源基因又不是细胞所固有的，和细胞固有基因的表达尚有差别。使用多种宿主细胞，可提高该系统的应用价值。（4）转基因系统（transgenic system）转基因系统将外源基因整合人动物的生殖细胞，使外源基因在部分或全部组织中表达。该系统和转染系统有一些相同的局限性，即外源基因常以多拷贝存在，整合的位置也和内源性基因不同。

（4）体外转录系统（in vitro system）体外转录系统是一种经典的方法。它应用体外转录的方法，结合缺失突变和点突变，来筛选哪些序列是启动子的功能所必需的，哪些序列对启动子的功能有影响，以及

哪些辅助因子对启动子或启动子中的某一片段有何种作用。

启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度。主要方法是用缺失试验来确定启动子的上游边界，即当缺失影响转录始时，说明该处就是启动子的上游边界；用缺失试验结合重组试验来确定下游边界。确定了启动子的位置后，可采用点突变来研究每个碱基在启动子中所起的作用。

研究蛋白质辅助因子与DNA（启动子）的相互作用可采用DNase、足迹法、凝胶阻滞法和硫酸二甲酯方法等。

关于转录调控或基因启动子的研究方法很多,除了较常用的报告基因(Luciferase), CHip, EMSA, pull-down外,还有结合芯片的方法.下面重点介绍五种:

1.Protein Arrays(蛋白芯片)

What they are:固定的转录因子阵列,利用标记的基因序列或蛋白质进行探索.

What to use them for:用于发现和证实转录因子的结合位点或蛋白-蛋白相互作用.

Pros(优点):能提供一种在广泛的因子中检测与特定序列结合的因子.

Cons(缺点):可能会错失一些同源因子和一些转录后的变化.

Things to keep in mind:蛋白分析提供了一种在DNA片段中筛选潜在的结合位点的方法.

但这种方法缺乏柔韧性,因此只局限于广泛的已研究的因子. Available Kits:

panomics: TF protein array I for DNA-protein Interactions

Active Motif: TransArray

2.Microsphere Assays(液相芯片)

What they are:一些微磁珠的集合在一起,每个能与唯一的因子结合位点耦联.

What to use them for:筛选转录因子的表达.

Pros(优点):提供一种广泛相对无偏见的的一次筛选手段,理论上,一次能检测100种不同转录因子.

Cons(缺点):需要特定的硬件设施(如luminex reader),不能完全的解释哪一种蛋白与哪一种蛋白结合.

Things to keep in mind:像RNAse保护试验一样,磁珠系统能定量转录因子保护寡核苷酸不被消化的能力.

来自匹兹堡大学医学中心luminex core facility主任Anna Lokshin就表示:这种微粒方法得到意想不到的

结果,因为它不会受到假说和初步数据的影响","通常你会在自己的知识领域里寻找,但是各自的知识领域

是受到限制的.

Available Kits:

Invitrogen: biosource 3-plex transcription factor assays

Marligen Biosciences: Multiplex transcription factor profiling Kit

3.Chromatin Immunoprecipitation(染色质免疫沉淀分析)

What they are:来自天然染色质的蛋白质-DNA交联复合物的免疫沉淀,通过pcr或微阵列来分析.

What to use them for:证实细胞内蛋白质-DNA天然结合的细节.

Pros(优点):是能体内进行的唯一分析方法,能详细解释蛋白容量的变化.

Cons(缺点):需要一种目的转录因子的抗体.同时ChIP相对EMSA来说,更为复杂和困难.

Things to keep in mind:不能说明白一种特定结合是否是功能性的,因此,我们需要利用转录活性分析

方法.ChIP很有用,但是需要与其他技术合用来解决整个难题. Available Kits:

Active Motif: ChIP-IT

Upstate: EZ ChIP

4.Oligonucleotide Arrays(寡核苷酸芯片)

What they are:固定的寡核苷酸结合位点阵列,一般用于探测核提取物核研发某种蛋白抗体.

What to use them for:筛选转录因子的表达物.

Pros(优点):提供一种相对广泛,无偏见的的一次筛选手段.

Cons(缺点):定性分析,需要进行研究的转录因子对象的抗体.

Things to keep in mind:不同的实验中存在着差异.

Available Kits:

Panomics: protein/DNA Combo Array

ArrayIt Transcription Factor Microarrays

5.Elisa-based assays

What they are:基于酶联免疫反应的转录因子结合分析.

What to use them for:定量转录因子的浓度

Pros(优点):快速,定量和高通量的特点

Cons(缺点):需要目的转录因子的一种抗体才能进行试验

Things to keep in mind:可以比传统的EMSA分析容纳更多的蛋白,并且能将信号放大,具有半定量的特点

Available Kits:

Clontech: TransFactor STAT3 Colorimetric Kit

Panomics: HIF ELISA kit

Active Motif:TransAM CREB Kit