分子生物学研究法(下).pptx
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运输功能
如载体蛋白，血红蛋白等 ，在生物体内运输各种物 质。
免疫功能
如抗体蛋白，参与生物体 的免疫应答。
18
蛋白质的功能与调控
调节功能
如激素，生长因子等，调节生物 体的生长发育和代谢过程。
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储存功能
如植物种子中的贮藏蛋白，动物体 内的肌红蛋白等，储存能量和营养 物质。
个性化医疗
根据患者的基因信息，制定个 性化的治疗方案。
药物基因组学
预测患者对药物的反应和副作 用，指导合理用药。
30
基因治疗的原理与应用
基因治疗的原理
通过导入正常基因或修复缺陷基因， 从而治疗由基因突变引起的疾病。
遗传性疾病的治疗
如视网膜色素变性、腺苷脱氨酶缺乏 症等。
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癌症治疗
利用基因编辑技术，修复或敲除癌症 相关基因，抑制肿瘤生长。
基因表达调控的层次
基因表达调控可分为转录前调控、转录水平调控、转录后调控和翻 译水平调控等多个层次。
基因表达调控的意义
基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢、免疫应答等生理过程具 有重要意义，同时也是疾病发生发展的重要因素。
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原核生物的基因表达调控
1 2 3
原核生物基因表达调控的特点
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DNA损伤的修复机制
直接修复
针对某些简单的DNA损伤，如碱 基错配，可通过特定的酶直接进行 修复。
碱基切除修复
通过识别并切除受损碱基，再合成 新的DNA片段进行修复。
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核苷酸切除修复
针对较严重的DNA损伤，如嘧啶 二聚体，通过切除一段包含受损部
运输功能
如载体蛋白，血红蛋白等 ，在生物体内运输各种物 质。
免疫功能
如抗体蛋白，参与生物体 的免疫应答。
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蛋白质的功能与调控
调节功能
如激素，生长因子等，调节生物 体的生长发育和代谢过程。
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储存功能
如植物种子中的贮藏蛋白，动物体 内的肌红蛋白等，储存能量和营养 物质。
个性化医疗
根据患者的基因信息，制定个 性化的治疗方案。
药物基因组学
预测患者对药物的反应和副作 用，指导合理用药。
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基因治疗的原理与应用
基因治疗的原理
通过导入正常基因或修复缺陷基因， 从而治疗由基因突变引起的疾病。
遗传性疾病的治疗
如视网膜色素变性、腺苷脱氨酶缺乏 症等。
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癌症治疗
利用基因编辑技术，修复或敲除癌症 相关基因，抑制肿瘤生长。
基因表达调控的层次
基因表达调控可分为转录前调控、转录水平调控、转录后调控和翻 译水平调控等多个层次。
基因表达调控的意义
基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢、免疫应答等生理过程具 有重要意义，同时也是疾病发生发展的重要因素。
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原核生物的基因表达调控
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原核生物基因表达调控的特点
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DNA损伤的修复机制
直接修复
针对某些简单的DNA损伤，如碱 基错配，可通过特定的酶直接进行 修复。
碱基切除修复
通过识别并切除受损碱基，再合成 新的DNA片段进行修复。
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核苷酸切除修复
针对较严重的DNA损伤，如嘧啶 二聚体，通过切除一段包含受损部
第六章分子生物学研究法
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第一节 基因表达研究技术
2 RNA的选择性剪接技术
❖ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、5’选择性剪 切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相 互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。
负对照， mRNA的 同义 链, 无杂交 信号
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正对照， UBQ10杂交信 号遍布于 整个 胚珠
第一节 基因表达研究技术
3. 原位杂交技术
❖ 荧光原位杂交（FISH）
❖ 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂 交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合，再通过与荧光 素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上 的 位置。
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寡核苷酸 介导的 DNA 突变技 术
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重叠延伸介导的定点诱变
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大引物诱变法
第二节 基因敲除技术
1. 基本原理
❖ 经典遗传学（Forward genetics）是从一 个突变体的表型 出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。
❖ 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传 学）首先从基 因序列出发，推测其表现
❖ T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最 为广泛的基 因敲除手段。
❖ 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报 告基因的 DNA序列整合到基因组DNA上，如 果这段DNA插入到目 的基因内部或附近，就 会影响该基因的表达，从而使该 基因“失 活”。
❖ LongSAGE技术。标签来自转录物3’端一段21bp的序列， 可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与 ShortSAGE方法类似，只是 用了不同的IIS类标签酶（ MmeI），并将程 序做了相应修改。
05分子生物学研究法99页PPT
PCR三步曲
变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃
变变 90变95变
70变75变
变变
PCR
变1) 将mRNA反转录为双链DNA. (2) 特点: A.稳定者组织mRNA中所含的全部或绝大部 分遗传信息.
名称
检测对象
探针
检测原理 处理过程
用途
Southern blot
DNA
标记单链核 酸
核酸复性中 碱基配对专
一性
琼脂糖电泳 后转膜
基因检测 （拷贝数）
Northern blot
RNA
标记单链核 酸
核酸复性中 碱基配对专
一性
变性琼脂糖 电泳后转膜
基因表达的 检测（表达
量）
Hale Waihona Puke Western blot蛋白
抗体
加标准分子量DNA Marker,测定分子量 加标准浓度的DNA，测定浓度
琼脂糖凝胶电泳技术要点
1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样 (p33) (1)低: 不利于小片段的分辨(扩散) (2)高: 不利于大片段的分辨(迁移不动) (3) 一般选1.0%
2. 凝胶要用缓冲液配( TBE 或 TAE ) 3. EB强致癌，带手套操作； 4. agarose (琼脂糖）－－－电泳
3.SDS－PAGE测定的是单体蛋白分子量；（多亚基不行） 4、SDS－PAGE不适于：
（1）电荷异常蛋白：组蛋白（＋电多） （2）构象异常的 蛋白 （3）带有较大辅基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。
PCR技术
1、原理 2、应用 3、技术要点
PCR技术原理
5’
3’
3’
5’
循环过程(32 次左右） 1.解链：94 ℃, 30 s 2.引物结合: ？ ℃ ，30 s 3. 延伸：72 ℃，？Min
第6章分子生物学研究法(下).ppt
7
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
➢ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
➢ 选择性剪接可分为：平 衡剪切、5选择性剪切、 3选择性剪切、外显子 遗漏型剪切及相互排斥 型剪切。
➢ 常 用 RT-PCR 法 研 究 某 个基因是否存在选择性 剪切。
2
6.1 基因表达研究技术
6.1.1 转录组测序
➢ 转录组 广义上指在特定生理条件或环境下，一个 细胞、组织或生物体中转录出来的所有RNA的集 合，包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。
➢ 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA。 ➢ 通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来描述
基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度， 是目前基因表达研究的基本思路。 ➢ 转录组研究的基本方法包括基因芯片技术和转录 组测序技术。
➢ 目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种 PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。
15
1)寡核苷酸定点突变 ➢ 原理：
✓ 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要 改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对。
✓ 合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完 全互补。
✓ 用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链DNA的 复制。
12
13
14
6.1.4 基因定点突变技术
➢ 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的 氨基酸序列，用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白 质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。
➢ 基因定点突变也可用于改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
➢ 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚 核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
➢ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
➢ 选择性剪接可分为：平 衡剪切、5选择性剪切、 3选择性剪切、外显子 遗漏型剪切及相互排斥 型剪切。
➢ 常 用 RT-PCR 法 研 究 某 个基因是否存在选择性 剪切。
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6.1 基因表达研究技术
6.1.1 转录组测序
➢ 转录组 广义上指在特定生理条件或环境下，一个 细胞、组织或生物体中转录出来的所有RNA的集 合，包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。
➢ 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA。 ➢ 通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来描述
基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度， 是目前基因表达研究的基本思路。 ➢ 转录组研究的基本方法包括基因芯片技术和转录 组测序技术。
➢ 目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种 PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。
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1)寡核苷酸定点突变 ➢ 原理：
✓ 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要 改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对。
✓ 合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完 全互补。
✓ 用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链DNA的 复制。
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6.1.4 基因定点突变技术
➢ 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的 氨基酸序列，用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白 质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。
➢ 基因定点突变也可用于改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
➢ 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚 核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。
《分子生物学研究法》PPT课件
解决办法：
1 用T4 DNA聚合酶除去PCR产物3’端多余的 核苷酸，成为平端后连接。
2 给平端载体的两个3’端各加上一个T，使 其与3’A突出的PCR产物互补，然后连接。
PCR产物与载体的A-T连接
mRNA
差 别 显 示
利 用
PCR
的
定
点
引物1或引物2的 5’端有不与模板
突
互补的突变。
变
利用PCR的定点突变
在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。 退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差； 退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。
嵌套PCR
( nested PCR)
嵌套PCR主要是为了提 高扩增产物的特异性。
嵌套PCR提高产物特异性的原理
单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。
循环条件的设定
变性---------→退火----------→链延伸
循环条件举例
循环 首轮循环 中间循环 末轮循环
变性 94℃ 5 min 94℃ 1 min 94℃ 1 min
退火 50℃ 2 min 50℃ 2 min 50℃ 2 min
链延伸 72℃ 3 min 72℃ 3 min 72℃10min
荧光定量PCR
1995年美国PerKin Elmer公司研制成功具有 革 命 性 意 义 的 荧 光 定 量 PCR 技 术 ， 它 融 合 了 PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技 术的高精确定量等优点。荧光定量PCR是直接 探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的 结 果 ， 不 需 要 PCR 后 处 理 或 电 泳 检 测 ， 完 全 闭 管操作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开 盖。
1 用T4 DNA聚合酶除去PCR产物3’端多余的 核苷酸，成为平端后连接。
2 给平端载体的两个3’端各加上一个T，使 其与3’A突出的PCR产物互补，然后连接。
PCR产物与载体的A-T连接
mRNA
差 别 显 示
利 用
PCR
的
定
点
引物1或引物2的 5’端有不与模板
突
互补的突变。
变
利用PCR的定点突变
在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。 退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差； 退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。
嵌套PCR
( nested PCR)
嵌套PCR主要是为了提 高扩增产物的特异性。
嵌套PCR提高产物特异性的原理
单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。
循环条件的设定
变性---------→退火----------→链延伸
循环条件举例
循环 首轮循环 中间循环 末轮循环
变性 94℃ 5 min 94℃ 1 min 94℃ 1 min
退火 50℃ 2 min 50℃ 2 min 50℃ 2 min
链延伸 72℃ 3 min 72℃ 3 min 72℃10min
荧光定量PCR
1995年美国PerKin Elmer公司研制成功具有 革 命 性 意 义 的 荧 光 定 量 PCR 技 术 ， 它 融 合 了 PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技 术的高精确定量等优点。荧光定量PCR是直接 探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的 结 果 ， 不 需 要 PCR 后 处 理 或 电 泳 检 测 ， 完 全 闭 管操作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开 盖。
分子生物学分子生物学研究方法ppt课件
ppt课件.
蛋白质芯片39的制备
ppt课件.
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
等离子表面共振技术
将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于 纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合 物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋 白发生相互作用，那么两者的结合将使 金属膜表面的折射率上升，导致共振角 度的改变。
该技术不需要标志物和染料，安全灵敏快速， 还可定量分析。缺点是需要专门的仪器。
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ppt课件.
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
Far Western印迹技术
用 32P 标 记 的 体 外 表达蛋白作探针,直 接检测与该蛋白发 生相互作用的蛋白 或表达该蛋白的 cDNA。
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ppt课件.
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
GST融合蛋白沉降技术
利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球 珠的亲和性，从混合蛋白质样品中 纯化得到相互作用蛋白。
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ppt课件.
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
酵母单杂交的基本原理：
①将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启 动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin 下游。
②将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激 活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞， 该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合， 就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。
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ppt课件.
6.2 基因敲除技术
基因敲除分两种：
完全基因敲除、条件型基因敲除（又称不完全基 因敲除）。
完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细 胞或者动物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特 定时间和空间的基因敲除。
噬菌体Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞 的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种 定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
第6章 分子生物学研究法(下)
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平衡剪切 5′选择性剪切 选择性剪切
5′ss 5′ss
3′ss 3′ss 3′ss 3′ss
5′ss
类型
5′ss
3′ss
3 ′选择性剪切
5′ss
外显子遗漏 相互排斥剪切 5′ss
3′ss
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提取不同组织的总RNA 提取不同组织的总 分离mRNA 分离
检 测 方 法
RT-PCR cDNA 以两端特异序列设计引物 PCR 观察PCR产物大小是否存在差异 产物大小是否存在差异 观察 存在差异 有选择性剪切 不存在差异 无选择性剪切 11
-
pUC origin of replication: 4317–4960 T7 RNA polymerase promoter: 5071–5089
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胚胎干细胞（ cell，ES） 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）
• ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。ES ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。 细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团 细胞的特点：能在体外培养， 细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全 能性。 能性。 • 因此，在体外进行遗传操作后，将它重新植回 因此，在体外进行遗传操作后， 胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织，将胚 胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织， 胎移植入母鼠子宫内， ES细胞有机会发育成 胎移植入母鼠子宫内，使ES细胞有机会发育成 小鼠或某种组织。 小鼠或某种组织。
反 向 互 补
反向 引物 R2
正向 诱变 引物 FM 物 1 重叠
P C R
反向 诱变 引物 RM 2
正向 引物 F2 物
PCR3 变DNA 变 引物F2 引物 R2 PCR4
6分子生物学研究法(下)
主要内容
基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术
1
基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术
6. 1 基因表达研究技术
基因表达系列分析技术 RNA的选择性剪接技术
1
原位杂交技术 基因定点突变
6.1.1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）
1
仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签 能够代表一种转录物的特征序列。 第二，将具有基因特异性的9碱基标签集中(连接)于一 个克隆载体中进行测序，就可以得到代表基因表达的标 签，标签的种类代表不同的转录物，而标签重复出现的 次数代表该转录物的拷贝数，即基因表达的丰度。
z (1) 生物素蛋白-dT为引物反转录 cDNA，限制性酶(锚定酶，AE)酶切。 每一个mRNA只收集其polyA尾与最 近的酶切位点之间的片段。
负对照，mRNA的 同义链, 无杂交 信号。
其次，SAGE可用于定量比较不同状态下的组
织细胞的特异基因表达。利用SAGE 技术分 析正常乳腺上皮细胞、原位癌、浸润癌和转 移癌基因表达的差异。1 通过比较,寻找正常 乳腺上皮细胞高表达,而在肿瘤细胞中却表 达消失的基因。
基因表达系列分析技术
RNA的选择性剪接技术
原位杂交技术
1
基因定点突变
6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方 式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接 异构体的过程。包括：1
平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、 外显子遗漏型剪接及相互排斥性剪接。
(a)平衡剪接 (b)5’选择性剪接 (c)3’选择性剪接 (d)外显子遗漏型剪接 (e)相互排斥性剪接
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酵母双杂交体系在细胞周期调节、信号传导、 肿瘤基因表达等诸多的研究领域，都有着广泛的应 用。
➢ 转录因子的两个主要结构域
a. DNA结合域(DNA binding domain, BD)，它可识别 效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之 结合。
若蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白 质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端 1个、2个、3个核苷酸等一系列长度仅相差一个核苷 酸的连续的DNA片段梯度群体。若有一种蛋白质已经 结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它将保护 这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不 能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自 显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标 记条带的空白区域，人们形象地体或AD
质粒载体，它具有亮氨酸基因(克隆到p用的特称
凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）
将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内 切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的 双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后， 再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化 DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生 一次磷酸二酯键断裂。
当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在 凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与 提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。
*
*
放射性标记的DNA
*
凝胶电泳
* B* * ** *
B
A
C
细胞蛋白质提取物
* 蛋白质与DNA结合
DNA-蛋白质结合物 电泳迁移缓慢
放射自显影
滞后带表明DNA与蛋 白质结合
在酵母GAL4的N端1-147位氨基酸区有一个DNA结合域(DNABD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸区有一个转录激活域(AD)。 一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段
（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。
按照所用转录因子的异同，可将酵母双杂交体系分 为LexA和GAL4两个类型，在此以GAL4类型为例。
1）同源重组
2）非同源重组
2 DNA与蛋白质相互作用研究
2.1 凝胶阻滞试验（gel retardation assay）
凝胶阻滞试验，又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay, EMSA ），是用于体外研究DNA与蛋 白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中， 由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量 的对数成反比。若此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在 特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或 DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。 定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状， 是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。
基因的体外改造
（2）体内改造
➢ 基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是 应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替 代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因 失活。
第六章
分子生物学研究方法(下)
本章主要内容
基因表达研究技术 蛋白质组学及研究技术
1 基因改造技术
（1）体外改造
1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal 31酶切
→连接酶。 2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚
合反应，连接反应。
➢ 定点突变（site-directed mutagenesis） 是指通过
1
(a) 32p *
1
(b) *
(c)
5
10
加入蛋白质X
4
8
10
加入DNaseI 凝胶电泳放
射自显影
10
足迹
5
1
AB
DNaseI 足迹实验
3 酵母双杂交系统(yeast-two hybrid system)
酵母双杂交体系也叫interaction trap（相互
作用陷井），是上世纪90年代初期发展起来的一种 敏感的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，也是体 内鉴定基因的方法。可有效地用来分离能与一种已 知的靶蛋白(target protein)相互作用的另一种蛋 白质及其编码基因，而且还可以用来确定蛋白质相 互作用的特异性结构域及其氨基酸序列。
b. 转录激活域(Transcriptional activation domain, AD)，它通过与转录机器(transcription machinery)中其它成分的结合作用，以启动UAS下 游基因进行转录。
➢ 酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4
研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的。
➢ 酵母双杂交体系的构建过程
（1）构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体
1）第一种质粒载体pGBT9，这种质粒载体又叫做诱饵质粒
载体或DNA-BD质粒载体(具trp基因) 。
把已知的 靶蛋白质编码 基因克隆到 pGBT9的多克隆 位点上。
通常将此种与BD融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Bait protein)
若将BD和AD这两个结构域的编码区分别克隆到两个载体 中,再把它们转入同一寄主细胞中进行表达，由此产生的GAL4 DNA-BD和GAL4 AD多肽，由于彼此之间不直接发生相互作用， 所以不能激活其相关的效应基因进行转录。
若将上述分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能 活性的转录因子，则能激活下游报告基因进行表达。
➢ 转录因子的两个主要结构域
a. DNA结合域(DNA binding domain, BD)，它可识别 效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之 结合。
若蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白 质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端 1个、2个、3个核苷酸等一系列长度仅相差一个核苷 酸的连续的DNA片段梯度群体。若有一种蛋白质已经 结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它将保护 这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不 能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自 显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标 记条带的空白区域，人们形象地体或AD
质粒载体，它具有亮氨酸基因(克隆到p用的特称
凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）
将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内 切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的 双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后， 再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化 DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生 一次磷酸二酯键断裂。
当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在 凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与 提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。
*
*
放射性标记的DNA
*
凝胶电泳
* B* * ** *
B
A
C
细胞蛋白质提取物
* 蛋白质与DNA结合
DNA-蛋白质结合物 电泳迁移缓慢
放射自显影
滞后带表明DNA与蛋 白质结合
在酵母GAL4的N端1-147位氨基酸区有一个DNA结合域(DNABD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸区有一个转录激活域(AD)。 一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段
（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。
按照所用转录因子的异同，可将酵母双杂交体系分 为LexA和GAL4两个类型，在此以GAL4类型为例。
1）同源重组
2）非同源重组
2 DNA与蛋白质相互作用研究
2.1 凝胶阻滞试验（gel retardation assay）
凝胶阻滞试验，又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay, EMSA ），是用于体外研究DNA与蛋 白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中， 由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量 的对数成反比。若此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在 特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或 DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。 定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状， 是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。
基因的体外改造
（2）体内改造
➢ 基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是 应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替 代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因 失活。
第六章
分子生物学研究方法(下)
本章主要内容
基因表达研究技术 蛋白质组学及研究技术
1 基因改造技术
（1）体外改造
1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal 31酶切
→连接酶。 2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚
合反应，连接反应。
➢ 定点突变（site-directed mutagenesis） 是指通过
1
(a) 32p *
1
(b) *
(c)
5
10
加入蛋白质X
4
8
10
加入DNaseI 凝胶电泳放
射自显影
10
足迹
5
1
AB
DNaseI 足迹实验
3 酵母双杂交系统(yeast-two hybrid system)
酵母双杂交体系也叫interaction trap（相互
作用陷井），是上世纪90年代初期发展起来的一种 敏感的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，也是体 内鉴定基因的方法。可有效地用来分离能与一种已 知的靶蛋白(target protein)相互作用的另一种蛋 白质及其编码基因，而且还可以用来确定蛋白质相 互作用的特异性结构域及其氨基酸序列。
b. 转录激活域(Transcriptional activation domain, AD)，它通过与转录机器(transcription machinery)中其它成分的结合作用，以启动UAS下 游基因进行转录。
➢ 酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4
研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的。
➢ 酵母双杂交体系的构建过程
（1）构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体
1）第一种质粒载体pGBT9，这种质粒载体又叫做诱饵质粒
载体或DNA-BD质粒载体(具trp基因) 。
把已知的 靶蛋白质编码 基因克隆到 pGBT9的多克隆 位点上。
通常将此种与BD融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Bait protein)
若将BD和AD这两个结构域的编码区分别克隆到两个载体 中,再把它们转入同一寄主细胞中进行表达，由此产生的GAL4 DNA-BD和GAL4 AD多肽，由于彼此之间不直接发生相互作用， 所以不能激活其相关的效应基因进行转录。
若将上述分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能 活性的转录因子，则能激活下游报告基因进行表达。