目的基因表达

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目的基因的检测与表达的方法

目的基因的检测与表达的方法先说说目的基因的检测吧。

有一种超酷的方法叫DNA分子杂交技术呢。

就像是给基因找对象似的，把含有目的基因的DNA片段弄成单链，然后用一个标记了的单链DNA探针去和它配对。

如果能配上对，那就说明有目的基因在呢。

这探针就像个小侦探，专门去找目的基因这个小目标。

还有基因探针检测法，这也是很厉害的。

这个探针能特异性地识别目的基因的序列。

如果样本里有目的基因，探针就会和它结合，然后通过一些特殊的手段，像放射性标记或者荧光标记啥的，就能让我们看到有没有目的基因啦。

再讲讲目的基因表达的检测。

抗原 - 抗体杂交就很有趣哦。

如果目的基因表达出了蛋白质产物，我们就可以用针对这个蛋白质的特异性抗体去检测。

就像一把钥匙开一把锁，抗体和蛋白质一结合，就能被检测到啦。

这就证明目的基因成功表达出蛋白质喽。

另外呢，还有一种检测方法是看有没有产生特定的性状。

比如说，要是把抗虫基因导入植物里，要是看到植物能抵抗害虫了，那可不就是目的基因表达的结果嘛。

这就像种瓜得瓜，种豆得豆一样直观呢。

对于目的基因的表达，还可以通过检测mRNA来判断哦。

因为基因要先转录出mRNA才能进一步翻译出蛋白质呀。

用反转录PCR技术就可以检测mRNA的存在。

把mRNA反转录成cDNA，然后再通过PCR大量扩增，这样就能知道有没有目的基因转录出mRNA啦。

宝子们，这些目的基因的检测和表达的方法就像一个个小魔法，让科学家们能够在基因的世界里探索，知道目的基因是不是在细胞里安了家，是不是发挥了它该有的作用呢。

是不是感觉基因的世界也很奇妙呀？。

外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。

PCR反应体系为：。

PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。

2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。

连接反应体系为：#3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。

4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。

目的基因的概念高中生物

目的基因的概念高中生物目的基因是指在遗传改良中人为选择的具有特定功能的基因。

它是通过基因工程技术插入到生物体中的外源基因，目的是改良生物体的特性，使其具有某种所需功能或者具备某种特定性状。

目的基因的出现源于人类对生物体进行遗传改良的需求。

通过选择具有所需特性的基因，科学家可以插入这些基因到目标生物体的染色体中，使其表达特定的基因产物，从而产生具有特定功能的生物体。

目的基因常常用于增强农作物的产量和抗逆能力。

例如，科学家可以插入抗虫基因到作物的基因组中，使其具有抗虫特性，减少使用农药对环境的污染。

此外，目的基因也被用于改良食物的质量和营养价值。

通过插入产生特定蛋白质的基因，可以使食物中的蛋白质含量增加，从而提高其营养价值。

此外，目的基因还可用于医学和药物生产领域。

基因工程技术使得科学家能够插入生产药物的基因到细菌或植物的基因组中，从而提高药物产量，并降低生产成本。

这种方法被广泛应用于生产胰岛素、生长激素等重要药物。

然而，目的基因技术也引发了一些伦理和风险问题。

一方面，目的基因技术的长期影响和可能的风险还需要深入研究。

例如，可能存在插入基因会导致其他不良基因变异的风险。

此外，目的基因技术也引发了关于基因修改是否符合伦理道德的争议。

部分人担心这种技术可能造成不可预知的后果并对生态环境产生负面影响。

在讨论目的基因技术时，应当进行权衡利弊和风险评估。

基因工程技术为人类社会带来了巨大的科学和经济利益，例如增加农作物产量和改善医药业务。

然而，我们也必须关注其潜在的风险和可能的影响，确保科学技术的发展不会给生态环境和人类健康带来严重的损害。

需要强调的是，对于目的基因技术的评估和监管需要多方面的参与。

科学家、政府、研究机构和公众都应该参与到这一讨论中，共同决定技术的应用和限制。

安全、伦理和社会等各个层面的因素必须综合考虑，确保对生物的改良和遗传工程技术的应用能够真正造福人类和社会。

6.目的基因的表达

IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子。拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节为主 • 正性调节 • 真核生物：真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（）指可影响自身基因表达活性的DNA序列。自身基因表达活性的序列。指可影响自身基因表达活性的序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件位于远端调控区的顺式作用元调控元件: 增强子,沉默子件(增强子沉默子增强子沉默子)
发热量低、需氧低、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作产物的产量、产率高，产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞：第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：常用有酵母、第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。

高中生物课件《目的基因获取和基因表达载体的构建》

d．要求
□ 模板： 23 _目_的__基__因__两__条_链___
原料：dNTP
酶：热稳定□24 __D_N_A__聚__合_酶_____(□25 ____T_aq__酶_______) 引物：人工合成的两条□26 __D__N_A__片_段______(引物 1，引物 2)
知识点一
知识点二
课时精练
②利用 PCR 技术扩增目的基因
a．PCR 含义：是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外 □19
__复__制__特__定__D_N_A__片__段______的核酸合成技术。
□ b．PCR 原理： 20 __D_N__A_双__链__复__制__。
知识点一
知识点二
课时精练
c．前提条件：有一段已知目的基因的□21 _____核_苷__酸______序列，以便根据这一序列合成□22 ____引__物________。
知识点一
知识点二
Hale Waihona Puke 课时精练d．构建过程
知识点一
知识点二
课时精练
e ．提取依据：根据基因的有关信息，如 □17 _基_因__的__核__苷__酸_序__列_ 、 □18
__基__因__的__功_能_____、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA 以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。
知识点一
知识点二
课时精练
提示
典题分析题型一目的基因获取方法的辨析 [例 1] 下列有关获取目的基是工作量大，具有一定的盲目性 B．由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工合成 D．PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成

目的基因在宿主细胞中的表达

T7噬菌体启动子表达载体系统：
T7噬菌体RNA 聚合酶活性很高，合成mRNA的的速率相当于大肠杆菌RNA 聚合酶的5倍。
外源目的基因在原核细胞的表达形式
包涵体：是外源基因的高表达蛋白在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种水不溶性蛋白质结构。易于分离纯化。具有正确的氨基酸序列，但因其空间构象错误，故一般无生物学活性。融合蛋白：将外源目的基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。具有稳定性好、表达效率高、较易于分离纯化的优点。
考虑外源目的基因的组成。主密码子和罕用密码子。
常见的原核细胞表达载体系统 Plac 启动子表达载体系统：以大肠杆菌乳糖操纵
子调控机制为基础设计和构建的表达系统。
PL 和PR启动子表达载体系统：
PL 和PR启动子是大肠杆菌λ 噬菌体中控制早期转录的启动子， PL 和PR 表达载体系统是该启动子构建的高效表达载体。
表达载体和受体菌
• GS115： Mut+ ， His• KM71： Muts， His• SMD1168： Mut+， His-，蛋白酶缺陷型 • pPIC3.5K：5’ AOX1，MCS，TT，3’ AOX1，His4，
Kanr， ampr，
• pPIC9K：
5’ AOX1，MCS，TT，3’ AOX1，His4，ampr， Kanr，Sig， 5’ AOX1-MCS-TT的两端为BglⅡ和BamHⅠ
在原核细胞中高效表达目的基因高效表达目的基因的基本策略优化表达载体的构建提高稀有密码子的表达频率构建基因高表达受体菌提高外源基因表达产物的稳定性优化工程菌的发酵过程
• 优化表达载体的构建

目的基因的表达

影响翻译效率的因素主要有：
1) SD序列与rRNA的16S亚基3’ 端序列的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。
2) 起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。
连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变也会对转译效率发生很大的影响。如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效；而当这个区域是由4个C 碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50％或25％。
有些强启动子会通读，干扰质粒的复制，结果使质粒的拷贝数反而下降。
所以，在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数（也就是基因的表达效率）控制在一个正常的水平上。
一、制约目的基因表达的因素二、阅读框架三、启动子的影响四、终止子的影响五、翻译过程对表达的影响
原核细胞在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。
（6）提高翻译水平常用的途径
➢ 包含体表达的缺点
当以包含体形式表达时，外源目的蛋白表达产物需经过变性、复性等手段才能得到有生物活性的蛋白。而提取的手段复杂，并且回收率较低。
未形成包含体的水溶性活性物质在提取过程中容易损失。
虽然目的基因产物以包含体形式表达有不少优点，而且近年来随着蛋白复性技术研究的发展，许多目的基因产物得以通过包含体变性、复性的方法以一定的收率得到最终的产品。
限制蛋白质合成的第一步，是发生在核糖体同mRNA分子结合的过程中的。
由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一是增加相应的 mRNA分子的数量。
影响mRNA分子合成速率的因素有两种：
第一种是启动子的强度；

第十一章目的基因的表达

➢ 目的基因在宿主细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调控序列的共同作用下完成的。
第一节目的基因表达的机制
一、目的基因的起始转录及mRNA的延伸
外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。
➢启动子的强度主要决定于启动子的结构组成。在原核细胞中，启动子DNA序列中两个高度保守区域是必需的（-10区和-35区）。但是启动子DNA序列中保守性较差部分和两个保守区之间的核苷酸数量也影响启动子的效率。
主要因素有以下几点：（1）SD序列与rRNA的16S亚基3'末端序列之间的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。（2）起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成对翻译能力的影响。（3）起始密码子之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合的影响。（4）基因末端转录终止区的影响。
第十一章目的基因的表达
1. 目的基因表达的机制 2. 目的基因表达的制约因素 3. 目的基因表达系统
➢ 基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。
➢ 基因工程技术的核心是基因表达技术。到目前为止，已构建了多种基因表达系统，包括原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统，不同表达系统具有各自特点。
有的载体的启动子后接有SD序列，而另一些载体的启动子后没有接SD序列，那么则需要目的基因上游带进SD序列。
若在大肠杆菌中表达真核基因或本身所含核糖体结合位点较弱的原核基因，则必须从外部同时提供启动子和有效的核糖体结位点。
•翻译起始密码子

构建基因表达载体的步骤

构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的主要步骤包括：
1.目的基因的获得：即使用限制性核酸内切酶切割质粒，露出黏性末端，再用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。

2.载体和目的基因的限制性酶切：用相同的限制性酶酶切载体和目的基因，使它们产生相同的黏性末端。

3.连接转化：将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键。

4.加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。

第1课时目的基因的获取、基因表达载体的构建

1．2基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的获取、基因表达载体的构建课堂知能验收对应学生用书P0051．基因工程主要操作步骤的顺序是()①基因表达载体的构建②将目的基因导入受体细胞③目的基因的检测与鉴定④目的基因的获取A．③②④①B．②④①③C．④①②③D．③④①②答案 C解析基因工程的主要操作步骤顺序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。

2．(2018·黑龙江哈尔滨三中高二验收试题)获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是()A．从基因组文库中获取B．从cDNA文库中获取C．直接从受体细胞中提取D．利用PCR技术获取答案 C解析获取目的基因的方法有多种，例如可以从基因组文库中获取目的基因，可以从cDNA文库中获取目的基因，也可以利用PCR 技术获取目的基因，故A、B、D不符合题意；受体细胞是接受导入的目的基因的细胞，受体细胞自身不含目的基因，C符合题意。

3．下列关于基因文库的说法，错误的是()A．可分为基因组文库和部分基因文库B．cDNA文库属于部分基因文库C．基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流D．同种生物的cDNA文库中基因数量较基因组文库少答案 C解析基因组文库中只有部分基因能够在不同物种之间进行基因交流。

4．下列有关PCR技术的说法，不正确的是()A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B．PCR技术的原理是DNA双链复制C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA答案 D解析PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链复制，A、B正确；利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，C正确；PCR扩增中目的基因受热变性后解链为单链，不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。

《目的基因的表达》课件

目的基因表达的机制
目的基因的表达是通过转录和翻译的过程实现的，同时也受到转录因子和后转录修饰的调控。 ## 1. 转录与翻译的过程基因的信息首先通过转录过程转化为RNA，然后通过翻译过程合成蛋白质。 ## 2. 转录因子的作用转录因子能够结合到目的基因的启动子区域，调控基因的转录过程。 ## 3. 后转录修饰的作用通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式对RNA和蛋白质进行修饰，影响目的基因的重要活动之一，对于理解生物体的发育和生理功能具有重要意义。 ## 目的基因表达的重要性目的基因的表达对生物体的正常生理功能起到关键作用。 ## 目的基因表达的未来研究方向未来的研究将更加深入地探究目的基因的调控机制和应用前景。
参考文献
1. 张三, 李四. (2020) 目的基因表达的研究进展. 《生物科学》, 10(2), 123-135.
目的基因表达与疾病
目的基因的异常表达常常与各种遗传疾病和环境疾病的发生和发展密切相关。 ## 1. 目的基因表达与遗传疾病目的基因的突变或缺失会导致遗传疾病的发生。 ## 2. 目的基因表达与环境疾病环境因素的影响可能改变目的基因的表达水平，导致环境疾病的发生。
目的基因表达的应用
目的基因的表达在生物技术和临床医学领域有着广泛的应用。 ## 1. 生物技术领域的应用目的基因的表达与基因工程、转基因技术等密切相关。 ## 2. 临床医学领域的应用目的基因的表达研究为疾病的诊断、治疗和预防提供了重要的理论基础。
2. 王五, 赵六. (2021) 目的基因的功能及表达调控机制. 《遗传学报》, 15(3), 456-467.
《目的基因的表达》PPT 课件
# 目的基因的表达
基因的表达是指基因中的信息在生物体内转化成蛋白质或RNA的过程。了解目的基因的表达机制对于研究基因功能和理解生物发育过程具有重要意义。

基因工程中目的基因的检测pcr法

基因工程中目的基因的检测pcr法基因工程中目的基因的检测PCR法在现代生物技术领域，基因工程扮演着至关重要的角色。

它涉及到对生物体的基因进行精确的修改和调控，以实现特定的科学或商业目标。

在基因工程的过程中，检测目的基因的存在和表达是至关重要的一步。

聚合酶链反应（PCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，已被广泛应用于这一领域。

PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下，对目标DNA 序列进行指数级扩增。

这一过程涉及到几个关键步骤：变性、退火和延伸。

通过高温将双链DNA变性为单链，然后通过降温使引物与目标序列特异性结合，在适宜的温度下，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链。

通过这一系列的循环，目标DNA序列得以在短时间内大量复制，从而便于检测和分析。

在基因工程中，PCR技术被用于多种目的。

它可以用于验证目的基因是否已成功导入宿主细胞。

通过设计特异性的引物，可以扩增出导入的基因片段，并通过凝胶电泳等方法进行检测。

PCR还可以用于检测目的基因的表达水平。

通过逆转录PCR（RTPCR）技术，可以将RNA转录为cDNA，然后通过PCR扩增，从而间接检测基因的表达量。

为了确保PCR检测的准确性和可靠性，必须严格控制实验条件。

引物的设计至关重要。

引物需要与目标序列完全匹配，并且具有适当的长度和GC含量，以确保高效性和特异性。

实验中的温度控制、试剂浓度和循环次数等参数也需要精确调控。

任何微小的偏差都可能导致结果的误判。

在应用PCR技术进行基因检测时，还需要考虑到可能存在的假阳性或假阴性结果。

假阳性通常是由于交叉污染或非特异性扩增引起的，而假阴性可能是由于模板量不足或扩增条件不适宜导致的。

因此，在实验设计中，应采取适当的对照和重复实验，以验证结果的可靠性。

随着PCR技术的不断发展，出现了许多基于PCR的衍生技术，如定量PCR（qPCR）、多重PCR和高通量PCR等。

这些技术不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还实现了对多个基因的同时检测，大大提高了实验效率。

《目的基因的表达及产物检测鉴定》学历案

《目的基因的表达及产物检测鉴定》学历案一、学习目标1、理解目的基因表达的概念和过程。

2、掌握目的基因表达的常用技术和方法。

3、学会运用不同的检测手段对目的基因的表达产物进行鉴定。

二、学习重难点1、重点（1）目的基因在原核和真核细胞中的表达系统。

（2）目的基因表达产物的检测方法，如电泳、免疫印迹等。

2、难点（1）目的基因表达调控的机制。

（2）复杂的检测技术原理和数据分析。

三、知识链接1、基因的结构和功能。

2、中心法则和遗传信息的传递。

3、蛋白质的合成和加工。

四、学习过程（一）目的基因表达的概念目的基因表达是指将特定的基因导入到受体细胞中，使其在受体细胞内转录和翻译，产生相应的蛋白质或 RNA 产物的过程。

这一过程是基因工程的核心环节，通过目的基因的表达，可以实现特定性状的改变或获得所需的生物产品。

（二）目的基因表达系统1、原核表达系统原核表达系统通常以大肠杆菌为代表。

其优点是生长迅速、培养成本低、遗传背景清楚、表达量高。

然而，原核细胞缺乏真核生物的转录后加工和翻译后修饰机制，可能导致表达产物的活性和稳定性受到影响。

2、真核表达系统真核表达系统包括酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。

真核表达系统能够对目的基因进行更复杂的转录后和翻译后修饰，使表达产物更接近天然状态，具有更好的生物学活性。

但真核表达系统的培养条件较为苛刻，操作相对复杂，表达效率可能较低。

（三）目的基因的表达调控目的基因的表达水平受到多种因素的调控，包括启动子的强度、转录因子的结合、RNA 加工和稳定性、翻译起始和效率等。

了解这些调控机制对于优化目的基因的表达至关重要。

（四）目的基因表达产物的检测1、蛋白质水平的检测（1）SDSPAGE 电泳SDSPAGE 是一种常用的蛋白质分离和检测技术。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质的分子量大小将其分离，然后用染色剂（如考马斯亮蓝）染色，观察目的蛋白的表达情况。

（2）Western blotting（免疫印迹）Western blotting 是一种基于抗原抗体特异性结合的检测方法。

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。

可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。

二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。

但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。

用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。

为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。

三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。

使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。

2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。

目的基因序列

目的基因序列目的基因序列是指在基因组中具有特定功能的基因序列。

基因是生物体遗传信息的基本单位，编码着生物体形态、功能和行为的特征。

目的基因序列的研究对于理解基因功能、疾病治疗和基因工程等方面具有重要意义。

目的基因序列的研究可以通过多种方法进行。

一种常用的方法是通过基因克隆技术来获取目的基因的序列。

基因克隆是指将目的基因从其所在的生物体中分离出来，并将其插入到载体中，然后将载体导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中表达。

基因克隆技术可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割和连接、DNA测序等步骤来获取目的基因的序列。

另一种常用的方法是通过基因组测序技术来获取目的基因的序列。

基因组测序是指对生物体的基因组进行全面的测序分析，可以获取到包括目的基因在内的所有基因的序列信息。

目前，基因组测序技术已经得到了极大的发展，可以高效、准确地获取大规模的基因序列数据。

通过对目的基因序列的深入研究，可以揭示其在生物体发育、生长、代谢和适应环境等方面的作用机制。

目的基因序列的研究可以帮助科学家们更好地理解基因功能。

通过对目的基因序列的分析，可以了解基因在生物体中的表达模式、调控机制以及与其他基因的相互作用关系。

这对于理解基因如何决定生物体的形态、功能和行为具有重要意义。

另外，目的基因序列的研究还可以揭示基因与疾病之间的关联，为疾病的预防、诊断和治疗提供重要的依据。

目的基因序列的研究还可以为基因工程提供重要的支持。

基因工程是指利用基因组编辑技术对生物体的基因进行修改和调控的过程。

通过对目的基因序列的深入了解，可以设计和构建具有特定功能和特征的基因组，为生物体的改良和优化提供技术支持。

目前，基因工程已经在农业、医药和环境等领域得到了广泛的应用，为人类的生产生活带来了巨大的改变。

目的基因序列的研究对于理解基因功能、疾病治疗和基因工程等方面具有重要意义。

通过对目的基因序列的深入研究，可以揭示基因的作用机制，为疾病的预防和治疗提供依据，同时也为基因工程的发展提供技术支持。

目的基因启动子终止子的顺序

目的基因的结构目的基因的结构包括启动子序列、转录起始位点、增强子序列、沉默子序列、终止子序列、polyA加尾信号和基因编码区等多个组成部分，它们按照一定的顺序排列，共同协作以实现基因的表达。

1. 启动子序列启动子序列是目的基因表达的关键区域，它决定了转录的起始位置和转录效率。

启动子序列通常与RNA聚合酶结合，并指导其与转录起始位点结合，从而启动转录过程。

在真核生物中，启动子序列通常位于转录起始位点上游，并包含多个转录因子结合位点，以调节基因的表达。

2. 转录起始位点转录起始位点是启动子序列中RNA聚合酶开始转录的位置，通常与启动子序列相邻。

在真核生物中，转录起始位点通常由一个特殊的碱基对（TSS）标记，该碱基对位于转录起始位点的上游序列中。

3. 增强子序列增强子序列是一种非编码DNA序列，它可以增强基因的表达水平。

增强子序列通常位于启动子序列的上游或下游，并可以与转录因子结合，以增强或抑制基因的表达。

在真核生物中，增强子序列的位置和功能通常是可变的，因此它们可以调节不同组织或发育阶段中的基因表达。

4. 沉默子序列沉默子序列是一种非编码DNA序列，它可以抑制基因的表达。

沉默子序列通常位于基因内部或其周围，并通过与转录因子或染色质修饰酶相互作用来抑制基因的表达。

在真核生物中，沉默子序列的位置和功能通常是可变的，因此它们可以调节不同组织或发育阶段中的基因表达。

5. 终止子序列终止子序列是目的基因表达的终止区域，它指导RNA聚合酶在转录结束时释放RNA链。

终止子序列通常包含一个特殊的终止信号，如polyA加尾信号，以指示RNA聚合酶停止转录。

在真核生物中，终止子序列通常位于转录起始位点的下游，并包含多个转录因子结合位点，以调节基因的表达。

6. polyA加尾信号polyA加尾信号是真核生物mRNA的末端结构，它由一个特殊的加尾信号和随后的polyA尾巴组成。

polyA加尾信号通过引导多聚腺苷酸化酶与mRNA结合来添加polyA尾巴，并有助于mRNA的稳定性、翻译和胞质定位。

课件2：3.2.1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建

因文
单链互补DNA
库（
DNA聚合酶催化
如
双链cDNA片段
cDNA
与载体连接
文
导入受体菌中储存
库
）
体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入受体菌群体基因组某种生物某个时期的mRNA
反转录
cDNA
与运载体连接导入受体菌群体部分基因（cDNA）PCR技术
DNA复制
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
解旋方式 DNA在高温下变性解旋
不场所同点酶
结果
体外复制耐高温的DNA聚合酶
大量的DNA片段
解旋酶催化
细胞内（主要在细胞核内）解旋酶、DNA聚合酶形成整个DNA分子
第
二
基关于因公表司达载体的构建
步
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使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
3 扩增方式：以指数方式扩增，即__2_n_（n为扩增循环的次数）
4 扩增过程：
4 扩增过程：
PCR扩增的计算：
（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 2n 个。（2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 N0∙2n个。
〘思考〙用DNA连接酶处理后会出现几种产物？
如何避免质粒的自我环化和目的基因反向连接的问题？
质粒
目的基因
将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的
连接方式有：
目的基因自连
自连
目的基因
质粒自连目的基因与质粒连接
质粒