蛋白质氨基酸含量的测定

(1)原理 微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基 本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少， 且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏 定氮器。
2.2 微量凯氏定氮法
(2)仪器
① 100ml凯氏烧瓶。 ② 微量凯氏定氮器。
(3) 试剂 ① 20g/L硼酸溶液。 ② 400g/L氢氧化钠。 ③ 1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶 液，临用时按1：5混合。 ④ 0.01000mol/L盐酸标准溶液 ⑤ 其他试剂同常量法。
(2) 食品中的蛋白质含量
在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同， 一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食 品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉 中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为 3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%， 稻米 为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜 为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4% 和油菜为1.5%左右。 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营 养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、 优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均 具有极重要的意义。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同， 故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质 含氮量为16%，即一 份氮素相当于6.25份蛋白质， 此数值（6.25）称为蛋白质系数。
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米， 荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米 为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70， 牛乳及其制品为6.38。
2.4 注意事项
（1）所用试剂应用无氨蒸馏水配制。 （2）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸 液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。 （3）若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大 量泡沫，加少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂， 防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。 （4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶 冷却，加入300g/L2~3ml过氧化氢后再加热。
③ 滴定
将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定 至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始 操作完全相同）。
(7) 结果计算
c(V2 V1 ) 0.014 F W 100 m
式中：W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸标准液的浓度，mol/L； V1—空白滴定消耗标准液量，mL； V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； m—样品质量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数。
硫酸铜 CuSO4
作用 ① 催化剂 2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑ Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不 再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝 绿色。 ② 可以指示消化终点的到达。 ③ 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
（4）蛋白质水解
蛋白质 胨 肽 氨基酸
在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、 赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和 缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依 靠食品提供，故被称为必需氨基酸，它们对人体 有极其重要的生理作用。
（5）蛋白质测定方法
测定蛋白质的方法
一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽 键和折射率测定蛋白质含量 ； 另一类是利用蛋白质中特定基团（氨基酸 残基、酸性和碱性基团 以及芳香基团等）测 定蛋白质含量。



加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解， 它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫 酸的沸点在3400C左右，而添加硫酸钾后，可使温度提 高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不 断地被分解 ，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故 沸点升高，其反应式： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO2 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高， 又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点， 但效果不如硫酸钾。
② 蒸馏、吸收
按图装好蒸馏装置 冷凝管下端浸入接受瓶液面之下 （瓶内预先装有50ml 40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6 滴）。
凯氏烧瓶内
加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml 400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。 用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min， 用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。
（5）硫酸铜 起到催化作用，加速氧化分解。硫酸铜也是 蒸馏时样品液碱化的指示剂 ，若所加碱量不足，分解 液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量。 （6）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样 5ml的比例增加硫酸用量。 （7）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引 起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化30min即可， 但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸 或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸 中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。 有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量 多时，呈较深绿色。
③ 吸收与滴定 加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待 吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱 酸性（k＝5.8×10-10 ），用酸滴定不影响指示剂的变 色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方 程式：
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
(4)测定方法
① 样品消化 ：样品消化步骤同常量法。将消化 完全的消化液冷却后，完全转入100mL容量瓶中，加蒸 馏水至刻度，摇匀。
②
蒸馏
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内 装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升， 以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发 生瓶内的水。 在接受瓶内加入10mL 40g/L硼酸及2滴混合指示剂， 将冷凝管下端插入液面以下。
蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质 含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。
： 凯氏定氮法 是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的 双缩脲法 染料结合法
酚试剂法 方法简便快速，Hale Waihona Puke Baidu多用于生产单位质量控制分析。
紫外分光光度法 水扬酸比色法 近红外光谱法 折光法 旋光法
蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法
主要学习
常量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法的原理、 测定方法及操作技能，要求同学们能组装仪 器，能独立进行实验。
2.1 常量凯氏定氮法
(1) 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中 的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。 根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
① 样品消化
消化反应方程式如下：
2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
浓硫酸具有脱水性
使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。
浓硫酸又具有氧化性 ，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫 酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2
2.3 样品的分解条件
（1）K2SO4或Na2SO4
（2）催化剂 ：CuSO4
C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑
：提高溶液的沸点
Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑
氧化汞和汞
良好的催化剂，但剧毒；
硒粉 （3）氧化剂 过氧化氢
硫酸钾
二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫 酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
② 蒸馏
在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加 热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
2 凯氏定氮法
蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测 定其含氮量，再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。 不同食品的蛋白质系数有所不同。
凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性 食品的蛋白质含量测定，但因样品中常含 有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含 氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常 将测定结果称为粗蛋白质。
第十章 蛋白质和氨基酸的测定
概述 凯氏定氮法 蛋白质的快速测定法 氨基酸总量的测定 氨基酸的分离与测定
1 概述
（1）蛋白质的生理功用及在食品中的作用
① 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的 重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生 命的活体都含有不同类型的蛋白质。 ② 人体的酸碱平衡、水平衡的维持； ③ 遗传信息的传递； ④ 物质的代谢及转运都与蛋白质有关； ⑤ 人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构 成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质； ⑥ 食品的重要营养指标。
(5) 操作步骤 样品消化 蒸馏、吸收
滴定
(6) 测定方法 ① 样品消化 准确称取均匀的固体样品0.5～3g,或半固体样品2～
5g,或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘 附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸， 小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在 通风橱内加热消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干 燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽除消化过程所产 生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失 后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h， 冷却至室温。
(2) 适用范围 (3)仪器
各类食品中蛋白质含量测定
① 500ml凯氏烧瓶 ② 定氮蒸馏装置
(4)试剂
①硫酸铜 ； ② 硫酸钾；③ 硫酸； ④ 40g∕L硼酸溶液： ⑤ 混合指示剂：1g∕L甲基红乙醇溶液与 1g∕L甲基蓝乙醇 溶液，临用时按2：1的比例混合。 或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴甲酚绿乙醇溶液， 临用时按1：5的比例混合； ⑥ 400g∕L氢氧化钠； ⑦0.1mol∕L盐酸 标准溶液
③ 滴定 ：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐 酸标准溶液滴定至微红色为终点。
(4) 结果计算
(V1 V0 ) c 0.014 F W 100% V2 m 100
式中:W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。
（3）蛋白质系数
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大， 大部分高达数万~数百万，分子的长轴则长数 nm~100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定 的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含 的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质 中还含有 微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮 则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。
凯氏定氮法：常量法、微量法、半微量及经 改进后的改良凯氏定氮法
微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少， 且有一套微量凯氏定氮器。 目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、 微量凯氏定氮法。 在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中 氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题， 即分解试样所用的催化剂。
吸取10.00ml样品消化稀释液，由进样漏斗进入反应室， 以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加 入10ml 400g/L氢氧化钠溶液的使呈强碱性，用少量蒸 馏 水洗漏斗数次，盖塞 ，进行水蒸气 蒸馏。冷凝管下 端 预先插入盛有10mL 4%（或2%)）硼酸吸收液液面 下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记 时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏 1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。