甘露聚糖酶活力的测定
甘露聚糖酶活力的测定
一、原理
甘露聚糖酶能从底物LBG(Gum, Locus Bean 洋槐豆粉)中水解产生还原糖。还原糖的产生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。
二、酶活力单位（U）的定义
在40℃、pH 6.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mL LBG底物溶液生成1μg还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），其中样品的酶活力以U/g（固体酶）或U/mL（液体酶）表示。
三、主要仪器
3.1 紫外可见分光光度计
3.2 电子天平：感量0.0001g
3.3 恒温水浴锅30~60℃可调，精度为0.1℃。
3.4 pH 计：精确至0.01
3.5 秒表：每小时误差不超过5s。
3.6 离心机：3000-4000g
3.7 移液器：1-5mL可调，精度1μL。
四、试剂与溶液配制
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。
4.1 0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：
称十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g，柠檬酸8.07g，溶于900mL蒸馏水中，用0.2M NaOH溶液或0.2M HCL溶液调至pH6.0，加蒸馏水定容至1.0L，混匀。
4.2 氢氧化钠溶液（200g/L）：
称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。
4.3 DNS 试剂：
称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（4.2），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。
4.4 LBG （洋槐豆粉）底物溶液，浓度10mg/mL：
准确称取1.00gLBG (洋槐豆粉，Sigma G0753)，徐徐加入90mL 0.05M pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）中，磁力搅拌缓慢加热，直至LBG完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min。冷却后，用0.05M pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至100mL，LBG底物溶液能立即使用，使用前适当摇匀。此溶液标记为10mg/mL LBG底物溶液pH6.0，4℃避光保存，有效期为3天。
4.5 10mg/mL甘露糖标准液
称取无水甘露糖1.000g（应在105℃烘至恒重的，一般2h），用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）溶液，定容于100mL。
五、标准曲线的制作
分别吸取10mg/mL甘露糖标准液（4.5）0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL于100mL 容量瓶中，用pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）稀释至刻度，得到0，100，200，300，400，500，600μg/mL的标准稀释液。取不同浓度稀释液各2mL于试管中，加2mL pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1），DNS试剂（4.3）5mL，于沸水浴沸腾5min（样品放入从新
沸腾计时），取出后立即用自来水冷却至室温，并加入蒸馏水定容至25mL ，混匀，以不含甘露糖的为空白，在540nm 处分别测定其吸光度OD 值，记录OD 值。
以吸光度OD 值为横坐标，以相应甘露糖浓度为纵坐标，绘制出标准曲线或作回归方程（R 2值要大于0.998才能使用，否则应重做）。每次新配制DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。
六、测定步骤
6.1 待测酶液的制备
固体酶样：准确称取1g 样品（微丸酶应先粉碎），精确至0.0001g 置于100mL 容量瓶中，加入约70mL 0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1），在磁力搅拌器上高速搅拌20min(这很重要，抽提时间不足对酶活影响很大)，用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至刻度（减去磁力搅拌棒的体积），摇匀，在离心机上以4000r/min 离心10min ，取1.0mL 上清液用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）作适当稀释（吸光度OD 值在0.2-0.4之间），等待反应。
液体酶样：吸取5mL 液体酶在离心机上以4000r/min 离心10min ，取1.0mL 上清液用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至100mL 作为待测酶液（用前作适当稀释；吸光度OD 值在0.2-0.4之间），等待反应。
6.2 测定
6.2.1 吸取10.0mL 10mg/mL LBG 底物溶液（4.4），40℃平衡10min 。
吸取10.0mL 经过适当稀释的待测酶液，40℃平衡10min 。
6.2.2 酶空白样的制备
吸取2.00mL 经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mL DNS 试剂（4.3），振荡3s 。然后加入2.0mL LBG 底物溶液（4.4），40℃保温20min ，沸水浴加热5min 。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL ，振荡3s 。以此作为下步反应空白调零样。
6.2.3 酶反应样
吸取2.00mL 经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0mL LBG 底物溶液（4.4）（已经过40℃平衡），振荡3s ，40℃精确保温20min 。加入5.0mL DNS 试剂（4.3），振荡3s ，以终止酶解反应。沸水浴加热5min ，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL ，混匀。以酶空白样（6.2.2）为空白调零，在540nm 出测定吸光度OD 值。需做2个平行。
查标准曲线或回归方程式，求出样品中还原糖量。OD 值以在0.2-0.40范围为宜，若不在此范围需改变稀释倍数后再做。
七、结果表示与计算按式（1）
20
N A X ?= …………（1） 式中：
X ——试样甘露聚糖酶的活力，U/g 或U/mL ；
A ——从标准曲线中查得的还原糖量，μg ；
N ——稀释倍数（从固体样品到最终液的总稀释倍数）；
20——20分钟的反应时间。
八、重复性
同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
乳酸脱氢酶制备
乳酸脱氢酶制备 原理: 乳酸脱氢酶（LDH）（EC1.1.1.27）存在于具糖无氧代谢途径的细胞中，为水溶性酶，催化如下反应： L（+）—乳酸+NAD+ →丙酮酸 + NADH +H+ 乳酸脱氢酶最早从牛心中分离并获结晶。制备的方法为捣碎心肌组织用水抽提，磷酸钙胶吸附，硫酸铵分级盐析及有机溶剂沉淀，最后结晶出乳酸脱氢酶。 乳酸脱氢酶活力检测原理是在pH10.0的条件下，LDH催化NAD±还原生成NADH。NADH在340nm有最大吸收，摩尔消光系数为6.2×103，NADH的分子量为663.44。 LDH活力单位定义为：25℃、每分钟催化生成1微摩尔NADH的酶量为1个活力单位。用紫外分光光度计测定酶反应进程的OD340的增量，可求出制备样品中的LDH活力。 试剂： (1)CaCl2?6H2O (2)Na3PO4 (3)冰乙酸 (4)0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2） (5)0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2） (6)0.3饱和度的硫酸铵溶液（19.5g/100ml） (7)丙酮
(8)硫酸铵粉末 (9)0.5mol/L DL-乳酸钠。 (10)2mmol/L NAD+溶液：称取133mg NAD+，溶于5ml蒸馏水中，加入约0.15ml 1mol/L NaOH 调pH为6.0，定容10ml，冰箱贮存。(11) 0.1mol/L pH10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 A液0.2mol/L甘氨酸溶液：称取15.01g甘氨酸用蒸馏水溶解，定容1L。 B液0.2mol/L NaOH溶液：称取8gNaOH用蒸馏水溶解，定容1L。 取100mlA液与64.0mlB液混合，蒸馏水定容200ml。 操作： 一、磷酸钙胶制备 （1）称取19.8g CaCl2?6H2O，溶于150ml蒸馏水中，用自来水稀释成1600ml。 （2）称取22.8g Na3PO4?12H2O溶于150ml蒸馏水中。 （3）将两溶液混合，用冰乙酸调pH至7.4，室温下放置，使磷酸钙胶沉淀。 （4）吸去上清液，4000r/min离心3min，收集胶体备用。 二、 LDH制备 1、LDH水提取 （1）取100g新鲜或短期冰冻保存的牛心，去除脂肪、血管，称重，切成小块，低温下绞碎。 （2）加入400ml冰冷的蒸馏水，冰浴中搅拌，提取20min。
甘露聚糖酶作用原理
β-甘露聚糖酶（endo-1,4-β-mannanase）是一种新型的酶制剂，属于一种半纤维素酶类，它除具有一般非淀粉多糖（NSP）酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外；近来很多研究表明，β-甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，因为它可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率。实际使用中还可看出，添加了β-甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。 NSP的其中一种组分是β-甘露聚糖（半乳甘露聚糖），其在豆粕中的含量高于其它常用的饲料原料。β-甘露聚糖除了消化率低之外，还对家禽具有多方面负面的生理影响。研究表明，即使是低浓度的β-甘露聚糖也可通过干扰胰岛素分泌和胰岛素样生长因子（IGF）生成而降低从肠道中吸收葡萄糖的速率和碳水化合物的代谢过程（Nunes和Malmlof,1992）。其它负面影响包括降低氮存留量、脂肪吸收率和氨基酸摄入量以及减少水的吸收而导致排泄物水分过多（Kratzer等，1967）。 -甘露聚糖在畜禽肠道细胞发育不完全，或在应激环境下，会过度刺激免疫反应，造成对生长性能的的伤害，引起不良免疫反应，摄食量下降，生长更加迟缓，造成体重轻的数量增加，群体均匀度变差。 表1 常见原料的β-甘露聚糖含量 β-甘露聚糖酶作用特点： ◆β-甘露聚糖酶是一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。 ◆消除饲料中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高豆粕的能量消化率，能给玉米豆粕型日粮提高100-150kcal/kg的代谢能。 甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染。减少肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡均匀度。 ◆降低肠道粘度，促进能量、蛋白、纤维素的消化和吸收。
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。 纤维素酶DNS酶活力测定方法 DNS, 活力, 纤维素酶, 测定 1 定义" |0 `. y6 t9 b" ^ 2 x 1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。 2 原理 纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。! Y" m& p' q; I& K B& e$ T( B4 } 3.试剂和溶液 3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定） 3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液 取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。4 C) c+ }( l2 R( M( p! L 3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）; h1 a. l3 Z3 k6 t2 | 4仪器和设备 4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃) 4.2分光光度计 含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。$ ]1 h& A) p) K 5测定步骤 5.1 标准曲线绘制. [* |! P6 u* G& u2 ^6 J4 Q 分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。1 H, `% F/ `7 X/ U. W 5.2待测酶液的制备（同β－葡聚糖酶酶活测定） 1 L- {5 h8 W; q+ V4 u2 Y 5.3 比色测定 精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40℃预热5min，加入经40℃预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40℃水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。 同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。 6.计算0 W+ i$ S: }( _1 o7 ], R5 m( N
血清乳酸脱氢酶同工酶测定
血清乳酸脱氢酶同工酶测定 （醋酸纤维素薄膜电泳法） [原理] 先将血清在醋酸纤维素薄膜进行电泳使乳酸脱氢酶的同工酶分离，然后在薄膜上进行酶反应，显色试剂中包括有底物（乳酸）、NAD+、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）和碘硝基四唑蓝（INT），NAD+和PMS起递氢作用，INT最后接受氢被还原生成紫色的甲臜类化合物。其反应如下： LD 乳酸+NAD+丙酮酸+NADH2 NADH2+PMS NAD++PMSH2 PMSH2 +INT PMS+INTH2 [试剂] 1．PH8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.05）：称取巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g，溶于热的蒸馏水中，冷后加蒸馏水至1L。 2．0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钾2.16g，磷酸氢二钠 （Na2 HPO4.2H2O）30.13g, 溶于蒸馏水中，并稀释至1L。 3．0.5mol/L乳酸钠溶液：吸取60%DL—乳酸钠溶液9.25ml,加蒸馏水至100ml。 4．显色试剂：临用前配制下列试剂： （1）1mg/ml吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）水溶液； （2）辅酶Ⅰ（NAD+）10mg，溶于pH7.5磷酸缓冲液1ml； （3）碘硝基四唑蓝[氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑]（INT）12mg，溶于pH7.5磷酸缓冲液3ml中； （4）0.5 mol/L乳酸钠溶液1ml。 其中（2）、（3）、（4）混合后为甲液，（1）为乙液；用时以甲液∶乙液=20∶1混合。应用前，将上述溶液充分混和；但PMS水溶液加入量为0.2ml，且应待其他三种溶液混和后再加。 4．洗脱液：正丙醇9份与二甲亚砜1份混匀即可。
甘露聚糖酶
Q/JCSW W 甘露聚糖酶 桂林精成生物科技有限公司发布
前言 本标准按GB/T 1.1- 2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》进行编写。 本产品适用于作饲料添加剂用。 本标准由桂林精成生物科技公司提出。 本标准起草单位：桂林精成生物科技公司。 本标主要起草人：李志双、王海珍、梁艳 本标准于2007年3月10日首次发布。
甘露聚糖酶 1 范围 本标准规定了饲用甘露聚糖酶的要求、试验方法、检验规则、以及标志、包装、运输、贮存、保质期。 本标准适用于本公司生产的作饲料添加剂用的甘露聚糖酶。 2 规范性引用文件 下列文件中的条文通过本标准中的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准大成协议的各方研究是否使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB／T 601 化学试剂滴定分析用标准溶液的制备 GB／T 602 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 5917 配合饲料粉碎粒度测定法 GB/T 6435 饲料水分的检测 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 10648 饲料标签 GB 13078 饲料卫生标准 GB/T 14699.1 饲料采样方法 GB/T 18823 饲料检测结果判定的允许误差 NY/T722 饲料用酶制剂通则 QB/T1803 工业酶制剂通用试验方法 国家质检总局[2005]75号令：定量包装商品计量管理办法 3 定义 3.1 甘露聚糖酶活力单位定义 在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1 mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。 4 要求 4.1外观和性状 粉酶为浅黄色粉末状；颗粒酶为浅黄色均匀颗粒状。 4.2 水份含量：粉酶≤12.0% ；颗粒酶≤12.0% 4.3 粒度: 粉酶：95％以上通过孔径为420μm40目的分析筛； 颗粒酶：95％以上通过孔径为420μm 30-80目分析筛。 粗灰分：≤8% 4.4 产品成分分析保证值: 见表1
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
甘露聚糖酶的测定方法
甘露聚糖酶活性测定方法 一．原理 样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。 二．定义 一个甘露聚糖酶活性单位（MNU）被定义为：在测定条件下，1秒钟内从甘露聚糖中产生1 nmoL相应还原糖－甘露糖所需的酶量（1 MNU=1 nkat）。 三．适用范围与安全性 本方法适用于来源于木霉属（Trichoderma）的甘露聚糖酶样品的测定。当检测其它来源的酶活时，本测定方法的直线性需要校正。 本测定方法中的DNS试剂在吸入后，接触皮肤和眼睛，或被误服后，对人体有害。四．试剂与仪器 所有试剂溶液均用去离子水配制。 1. 柠檬酸缓冲液（0.05M,pH5.3） 溶解10.5 g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于800mL水中，并用1M氢氧化钠调节pH至5.3（消耗约110mL），再用水定容至1000mL。 2. 底物－0.3% 称取0.6 g刺槐豆胶（Sigma G-0753），溶于约80℃的柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌，加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。将不溶的沉淀物离心（1000rpm离心10min），并用柠檬酸缓冲液定容至200mL。将此底物溶液在-20℃下冰冻保存。临用前，将底物溶液在沸水浴中缓慢溶解至80℃左右后使用。 3. DNS试剂 溶解50.0 g3,5-二硝基水杨酸（Sigma D-0550）于4000mL水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0 g氢氧化钠，使之完全溶解，再继续磁力搅拌，分数次少量加入1500 g四水合酒石酸钾钠，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000mL。如果溶液不澄清，用Wheatman 1号滤纸过滤，然后室温保存于棕色瓶中。 4．仪器 恒温水浴锅50℃ 恒温水浴锅100℃ 试管旋涡磁力搅拌器 分光光度计 五．测定条件 底物半乳甘露聚糖 pH 5.3 温度50℃ 0.5℃ 保温时间5min 六．样品处理 用柠檬酸缓冲液稀释被检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。
乳酸脱氢酶LDH法操作说明
LDH法细胞毒性检测： 原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率 LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。 乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。该实验方法操作简便、快速，可应用于CTL 和NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有LDH 法测定CTL 活性的试剂盒。 同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组 按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞） 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶
操作流程： 设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基 实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞 设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基 设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×） 设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×） 设立背景对照组：100μl培养基 250g离心4分钟 37℃孵育4小时 离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组 250g离心4分钟 取上清50μl转移至另一孔板 （可选）于独立的孔中加50μl LDH阳性对照（1：5000） 于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物 室温避光孵育30分钟 添加50μl终止溶液 490nm测吸收值 1.靶细胞接种数目的优化 1.1.设立检测板 1.1.1.准备靶细胞：调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl，使用与细胞毒分析相同的培养 基及孔板终体积。例如，若以50μl/孔的靶细胞及50μl/孔的效应细胞接种，则以100μl/孔梯
过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶活性的测定（比色法） 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。 一、仪器、药品与材料 （一）实验材料 新鲜植物组织。 （二）仪器与用品 分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。 （三）试剂 １．愈创木酚。 ２．30％过氧化氢。 ３．100 mmol/L 磷酸缓冲液pH 6.0。 ４．反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 % 过氧化氢19 μL，混合均匀，保存于冰箱中备用。 二、实验步骤 1．称取植物材料0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以4000 rpm 低温离心15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。 2．取2支试管，于1只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。
乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)
乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(二硝基苯肼微板法) 简介： 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase ，LDH 或LD)属于氧化还原酶，能够催化氢氧原子或电子从一中底物转移到另一种底物上乳酸脱氢酶是糖酵解和糖异生的一个极其重要的酶，含有锌离子，广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中，能可逆的催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还原反应。其反应公式： 乳酸+NAD +→丙酮酸+NADH+H +。 L →P 为正向反应；P →L 为逆向反应，通过酶标仪检测440nm 处吸光度，进测得的丙酮酸钠含量计算酶的活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ① 血浆、血清样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定， -70℃冻存，用于LDH 的检测。 ②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，-70℃冻存，用于LDH 的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高活性的LDH ，可以使用蒸馏水稀释。 ④(选做)样品准备完毕后可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计 算单位蛋白重量组织或细胞内的LDH 含量。 2、 制作标准曲线：用LDH Assay buffer 准确稀释丙酮酸标准(5mmol/L)至0.5 mmol/L ， 按下表制备标准曲线。 编号 名称 TE0158 50T TE0158 100T Storage 试剂(A): 丙酮酸标准(5mmol/L) 1ml 1ml 4℃ 避光 试剂(B): LDH Assay buffer 1.5ml 3ml 4℃ 避光 试剂(C): NAD Buffer 0.3ml 0.6ml RT 试剂(D): 二硝基苯肼溶液 1.5ml 3ml 4℃ 避光 试剂(E): 碱性显色液 5.25ml 10.5ml RT 使用说明书 1份 加入物 0 1 2 3 4 5 丙酮酸标准(0.5mmol/L)(μl) 12.5 25 50 75 100
_甘露聚糖酶的研究及应用进展
第24卷第6期2010年12月 白城师范学院学报 Journal of Baicheng Normal College Vol．24，No．6Dec．，2010 β－甘露聚糖酶的研究及应用进展 王兆淼 （白城师范学院生物系，吉林白城137000） 摘要：β－甘露聚糖酶是重要的饲用酶制剂之一，是一种新型饲料添加剂．应用于猪、 鸡、鸭和水产动物日粮，可提高饲料的利用效率，促进动物生长，减少养殖业环境污染等作用．作者从β－甘露聚糖酶的来源、作用机理、在生产中的应用等方面阐述了饲用β－甘露聚糖酶的研究及应用情况． 关键词：β－甘露聚糖酶；作用机理；应用 中图分类号：O629文献标识码：A 文章编号：1673-3118（2010）06-0064-03收稿日期：2010－10－08 作者简介：王兆淼（1981———），男，白城师范学院生物系助教，在读硕士，研究方向：动物营养与饲料学． β－甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究 的热点之一，也是近10年来在美国应用最广泛的饲用酶制剂之一．中国饲用甘露聚糖酶的研究始于2006年，是对玉米/豆粕型日粮最有效的饲用酶制剂，畜禽和鱼类的消化酶系不含β－甘露聚糖酶，添加β－甘露聚糖酶主要有促进动物生长，控制、预防动物疾病，提高动物的饲料转化效率；促进养分消化，改善动物肠道微生物生态，改善动物机体的健康状况；降低肠道内容物的黏稠度，减少粪便排泄，减轻环境污染；提高微量元素的生物利用率等作用．目前，β－甘露聚糖酶在北美和欧洲市场已得到广泛的应用． 1β－甘露聚糖酶的来源 β－甘露聚糖酶（endo －β－1， 4－mannanase ）属于半纤维素水解酶类，以内切方式降解β－1，4糖苷键，作用底物为甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳 甘露聚糖等，近来很多研究也表明，甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂．β－甘露聚糖酶来源广 泛， 包括植物、真菌、放线菌甚至软体动物，其中，微生物是产生β－甘露聚糖酶的主要来源，但哺乳动物体内不含此酶． 2 β－甘露聚糖酶的作用机理 2．1 去除β－甘露聚糖的抗营养作用 甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚 糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且在许多植物中大量积累，如玉米、小麦、菜籽粕及麦麸中含量占非淀粉多糖（NSP ）比例分别达12%、11%、20%和34%．特别是β－半乳甘露聚糖和β－葡甘露聚糖是所有豆科（如豆粕）植物细胞壁的组成成分，在豆粕中含量最高（15－18g /kg ）．它与其他非淀粉多糖围绕或缚住细胞中的养分（蛋白质、淀粉和脂肪等），动物的内源性消化酶难于消化这些细胞壁成分，从而降低了日粮的养分利用率．由于畜禽和鱼类的消化酶系中不含此酶，在饲料中添加β－甘露聚糖酶可水解β－甘露聚糖 高分子中的β－1，4糖苷键，释放出与之结合的养分、微量元素等，促进营养物质的消化和吸收，降低 肠道粘度，预防动物腹泻，同时促进畜禽生长，减少养殖污染． 2．2提高动物肠道粘膜的完整性 β－甘露聚糖酶可以直接作用于肠黏膜，切断肠上皮细胞与病原菌的结合点，即碳水化合物核心基座、 蛋白质和蛋白糖；又因－甘露聚糖酶的反应产物甘露寡糖，可以竞争性地与某些病原菌结合，从而减少了这些有害菌与肠粘膜上皮细胞的连接，进而减少了发病的几率，达到防病抗病和治病的目的． 4 6
木聚糖酶检测方法
木聚糖酶活力的测定 分光光度法 1 原理 木聚糖酶能将底物木聚糖（本实验采用Xylan from oat spelt，燕麦木聚糖，Sigma NO. :X0627）降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。 2 木聚糖酶活力单位（U）的定义 在40℃、pH值为5.0的条件下，1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 μmol还原糖（以木糖表示）所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。其中样品的酶活力以U / g（固体酶）或U / mL（液体酶）表示。 桦木木聚糖（Xylan from birch wood）山毛榉木聚糖（Xylan from beechwood） 3 主要仪器 3.1 分光光度计 3.2 精密电子天平 精确至0.0001 g。 3.3 恒温水浴锅 30-60℃可调，精度为0.1℃。 3.4 酸度计 精确至0.01。 3.5 秒表 每小时误差不超过5s。 3.6 刻度试管（15mL） 带玻璃塞，10支以上。 3.7 移液管（0.5、1、2、5、10mL） 3.8分样筛 孔径为0.25 mm（60目）。
3.9 分析天平 精确至0.001 g。 3.10 磁力搅拌器 附加热功能。 3.11 电磁振荡器 3.12烧结玻璃过滤器 孔径为0.45 μm。 3.13 离心机 3000 r/min 3.14 冰箱 4 试剂与溶液配制 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。 4.1 氢氧化钠（NaOH）溶液（浓度为200 g/L） 称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。 4.2 乙酸（CH3COOH）溶液（浓度为0.1 mol/L） 吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。 4.3 乙酸钠溶液（CH3COONa）（浓度为0.1 mol/L） 称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100mL。 4.4 乙酸——乙酸钠（CH3COOH — CH3COONa）缓冲溶液（浓度为0.1 mol/L，pH为 5.0） 称取三水乙酸钠19.17 g，加入冰乙酸3.60 mL。再加水溶解，定容至2000 mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。用精密pH试纸检定。 4.5 木糖（C5H10O5）溶液（浓度为10.0 mg/mL） 称取无水木糖1.000 g，加乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100 mL。 4.6 木聚糖溶液（浓度为10.0g/L） 称取木聚糖（Sigma X0627）1.00 g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90 mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30 min，加入0.8 mL冰乙酸。继续磁力搅拌，测定其pH值。如果pH值为5.0，用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0，
酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定 一、试剂与溶液 1. 三氯乙酸 称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。 2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL） 精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。 吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。 3. 氢氧化钠溶液（20g/L） 称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。 4. 盐酸溶液 1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。 0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。 5. 酪蛋白溶液（10.0g/L） 称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤 1. 标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1 L-酪氨酸标准溶液 分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。 2. 样品的测定 待测酶液的制备：称取酶样品1g。然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。 测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，
乳酸脱氢酶细胞毒性检测
产品简介： 产品编号产品名称产品包装产品价格 C0016 100次176.00元碧云天的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也称乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)或乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(LDH Release Assay Kit)，是一种基于diaphorase催化的INT显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性或检测其它样品中的乳酸脱氢酶活性的试剂盒。 本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖和细胞毒性检测。 细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。 本试剂盒的基本原理是，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。该酶联反应原理的示意图如下： 可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中乳酸脱氢酶的活性。一个试剂盒可进行100次检测。 包装清单： 产品编号产品名称包装 C0016-1 LDH释放试剂 1.5ml C0016-2 乳酸溶液2ml C0016-3 酶溶液1ml×2 C0016-4 INT溶液(10X) 0.2ml C0016-5 INT稀释液2ml —说明书1份 保存条件： -20℃保存，一年有效。C0016-3需注意避免反复冻融。C0016-4需避光保存。试剂盒解冻后可以短期4℃存放，2-3天内有效。 注意事项： 冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活，4℃可放置2-3天。建议样品准备好后尽量当天完成测定。 如果检测细胞培养液中的乳酸脱氢酶，由于血清含有乳酸脱氢酶，建议血清的使用浓度不要超过1%，并最好使用热灭活血清。如果一定需要使用10%血清，在检测时一定要设置没有细胞，但加入了相同体积培养液的对照孔，以用于消除背景。 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。
乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒说明书 微量法
乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0685 规格：100T/48S 产品内容： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体7mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入1.3mL双蒸水充分溶解备用，配好后可分装成小管-20℃保存，可保存两周，禁止反复冻融； 试剂三：液体7mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存； 丙酮酸钠标准液：液体1mL×1支，4℃保存，2μmol/ml。 产品简介： LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD+/NADH之间互变。 LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：
1.细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2.血清（浆）样品：直接检测。 3.丙酮酸钠标准液：取100μL标准液，倍比稀释至1、0.5、0.25、0.125、0μmol/mL，用2、1、0.5、 0.25、0.125、0μmol/mL做标准曲线。 二、测定操作表： 1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。 2.样本测定 试剂名称(μL)测定管对照管标准管待测样本1010- 标准液--10 试剂一505050 试剂二10-- 蒸馏水-1010 充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴15min 试剂三505050 充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min 试剂四150150150充分混匀，室温静置3min，取200μL转移至微量玻璃比色皿或在96孔板中，450nm下测定吸光度，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需要设一个对照。
芽孢杆菌产甘露聚糖酶酶活稳定的提高
目录 摘要 0 ABSTRACT (1) 第一章绪论 (2) 1.1β-甘露聚糖酶的研究现状 (2) 1.1.1β-甘露聚糖酶的来源 (2) 1.1.2β-甘露聚糖酶的性质 (3) 1.1.3β-甘露聚糖酶的诱导 (3) 1.2β-甘露聚糖酶的纯化 (4) 1.2.1 纯化的意义 (4) 1.2.2 分离纯化工艺 (5) 1.3β-甘露聚糖酶的稳定性及稳定化 (6) 1.4β-甘露聚糖酶的应用 (7) 1.4.1石油钻采 (7) 1.4.2饲料添加剂 (7) 1.4.3食品保健 (7) 1.4.4造纸工业 (8) 1.4.5纺织工业 (8) 1.4.6工具酶 (8) 1.5研究目的和研究内容 (8) 1.5.1研究目的 (8)
1.5.2研究内容 (9) 第二章枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的产生及性质 (9) 2.1实验仪器与材料 (9) 2.1.1实验仪器与设备 (9) 2.1.2试剂 (10) 2.1.3菌种 (10) 2.1.4培养基 (11) 2.2实验方法 (11) 2.2.1粗酶液的制备 (11) 2.2.2酶活的测定 (11) 2.2.3温度对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (13) 2.2.4不同浓缩倍数对β-甘露聚糖酶酶活稳定性影响 (13) 2.2.5反复冻融对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (13) 2.2.6激活剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14) 2.2.7防腐剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14) 2.2.8金属离子螯合剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14) 2.3实验结果与分析 (14) 2.3.1温度对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14) 2.3.2不同浓缩倍数对β-甘露聚糖酶酶活稳定性影响 (15) 2.3.3反复冻融对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (16) 2.3 反复冻融情况下酶的稳定性 (16) 2.3.4保护剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (16)
第四章习题
1. 酶活力测定应在（） A.零级反应期 B.一级反应期 C.二级反应期 D.混合期 2. 酶活力测定速率法又称（） A.二点法 B.终点法 C.连续监测法 D.平衡法 3. 下列酶在4℃冰箱中稳定性最差的是（） A.LDH B.ALT C.ALP D.CK 4. V要达到Vmax的90%以上，[S]应为Km的（） A.2倍 B.5倍 C.10倍 D.100倍 5.在测定酶活性时要测定酶促反应的初速度，其目的是( ) A.为了节省底物的用量 B.为了节省酶的用量 C.为了节省反应的时间 D.为了提高酶促反应的灵敏度 E.为了防止各种干扰因素对酶促反应的影响 6.与NAD+偶联的工具酶是（） A.尿酸酶 B.甘油氧化酶 C.乳酸脱氢酶 D.葡萄糖氧化酶 7. Trinder反应中最常用的色原是（） A.联苯胺 B.邻联茴香胺 C.4-AAP和酚 D.2、4-二氯苯酚 8.关于酶活性国际单位定义，下列叙述哪项是正确的？ A.在特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底物的酶量 B.在最适条件下，1分钟能转化1微摩尔底物的酶量 C.在标准（25度）条件下，1分钟能转化1微摩尔底物的酶量 D.在标准（25度）条件下，1秒钟能转化1微摩尔底物的酶量 E.在特定条件下，1秒钟能转化1摩尔底物的酶量 9.以NAD（P）为指示系统的酶活性测定主波长应设置为 A.293nm B.340nm C.380nm D.405nm E.410nm 10.溶血标本测定CK时结果明显偏高的机制是 A.红细胞中含丰富的CK B.红细胞中含HB C.红细胞中含G6PD D.红细胞中含AD E.红细胞中含AK 11.如果样品对测定单色光有干扰吸收，为抵消这一影响应采用( ) A.试剂空白 B.样品空白 C.溶剂空 D.蒸馏水空白 E.平行操作空白 12.当反应速度为最大反应速度的80％时，Km等于( A ) A.1／4[S] B.1／2[S] C.3／4[s] D.[s] E.2[s] 13.溶血标本对酶活力测定有影响时应选择( ) A.底物对照 B.时间对照 C.样品对照 D.溶剂对照 E.蒸馏水空白 14. 下列影响酶活性测定的因素除了（） A. 缓冲液的种类和离子强度 B.最短pH C.反应温度 D.激活剂浓度 E.比色皿光径
09甘露聚糖酶的检测方法
生物科技股份有限公司 颁发部门：品管部 技 术 标 准 甘露聚糖酶 酶活力的检测方法 页码：共2页 第1页 1. 目的 建立甘露聚糖酶酶活力的测定方法，为各部门人员测定甘露聚糖酶活力提供依据。 2. 适用范围 适用于饲料添加剂的饲料酶产品，也适用于添加甘露聚糖酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。 3. 方法原理 β-甘露聚糖酶可以将槐豆胶中的β-甘露聚糖水解成甘露糖及其它还原性碳水化合物，这些物质可以同DNS试剂发生显色反应，可用分光光度计测定其色度，计算其酶活力。 4. 定义 在55℃、PH4.8～PH5.0条件下，1min分解槐豆胶中的β-甘露聚糖产生具有还原能力相当于1μmol 甘露糖所需的酶量，规定为1个酶活单位（实为国际单位IU），以μmol /min表示。 5. 试剂和溶液 5.1 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH4.8-5.0） 称取醋酸钠16.06g，醋酸4.92g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，配好后用PH计校正。 5.2 DNS试剂 取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中加热，于热溶液中依次加入3.5—二硝基水杨酸6.3g，NaOH 2lg，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色试剂瓶中，室温下放置15天以后使用，使用有效期一个半月。 5.3 0.5%槐豆胶溶液 用PH4.8～ PH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制, 槐豆胶为SIGMA试剂。 5.4 7 %甘露糖标准溶液 精确称取经105℃烘至恒重的甘露糖1.0000 g,用蒸馏水定容至100mL容量瓶中制成1%甘露糖标准溶液。 6. 仪器与设备 6.1 恒温水浴锅60±2℃ 6.2 紫外分光光度计UV1601 6.3 电子天平(0.001g) 6.4 漩涡混合器 7. 测定步骤 7.1 甘露糖标准曲线的绘制 分别吸取1%甘露糖标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水制成每mL 分别含甘露糖200，400，600，800，1000，1200μg的标准液。各取不同浓度标准液0.5mL于试管中，加2mL Ph4.8-5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液,加2.5 mL DNS试剂煮沸5分钟。冷后加水5 ml，摇匀，520nm 处测定光密度，以0.5 mL水代替标准液来作空白。以所得的光密度值为横坐标，以对应的标准甘露糖 批准 日期 审核 日期 编制 日期 生效日期：