第10章 蛋白质的分离与测定技术
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• • • • 第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS-PAGE 水平方向反映出蛋白在pI上的差异; 垂直方向反映出它们在分子量上的差别
• 二、通过层析性质的检测 • 各分级组分的比活力应当恒定，则得到的组 分是均一的。 • 三、免疫化学法 • 免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射 免疫、酶标免疫分析、发光免疫分析和 Western blotting等。 • 四、蛋白质化学结构分析法
• 蛋白质结晶即在一定的溶剂条件下，降低分 散相的溶解度，使溶质处于过饱和状态，此 时溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形 式形成晶核，然后溶质分子再以相互对撞的 方式有序而反复地堆砌到晶核上。于是晶核 长大，晶体形成。 • 二、结晶条件 • 物质能否结晶主要决定于物质的本性，但具 有结晶能力的物质进行结晶时还必须具备一 定条件，即样品的纯度、溶液的饱和度和溶 剂的性质等三个主要条件，
第四节 蛋白质的纯度标准
• 一、电泳法 • 如果样品在凝胶电脉上显示一条区带，说明样品在其荷 质比方面是均一的。 • 不同pH下电泳，出现一条区带，说明样品的分子量是均一的， 因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。 • 等电聚焦电泳 如果只出现一条区带，那么足以证明此蛋白 质为均一蛋白质 • 脲的凝胶电泳用于鉴定在低离子强度下难溶的蛋白质纯度。 • 双向电泳
• 三、冷冻干燥 • 冷冻干燥(Lyophilization)，是先 将溶液或混悬液冷冻成固态，然后 在低温和高真空度下使冰升华，留 下干物。 • 四、真空干燥 • 五、喷 雾 干 燥 • 将料液(含水50%)喷成雾滴分散于热 气流中 • 六、滚筒干燥 • 将已经蒸发至相当稠度的液体在加 热面展成薄层进行干燥。
• 二、常压吸收干燥 • 常压干燥是在密闭空间内用干燥剂吸收水或 溶剂。此法的关键是选用合适的干燥剂。 • 1．干燥剂分类 按照脱水方式可以分为三 类: • (1)能够与水可逆地结合为水合物。 • 如无水氯化钙。 • (2)能够与水作用生成新的化合物， • 如五氧化二磷、氧化钙等。 • (3)能够吸去微量的水及溶剂， • 如分子筛。
蛋白质分离纯化方法：
• • • • • • 溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法 分配系数不同：如分配层析法 吸附性不同：如吸附层析法 在电场中运动速度不同：如电泳法 沉降系数或密度不同：如离心法 分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE 法 • 生物学特性不同：如亲和层析法 • 以上提取纯化方法的适当结合，在多数情况 下，足以获得纯化的蛋白质。
（三）提取后的进一步纯化
• 1、选择性变性沉淀除去杂质； • 2、分段盐析及有机溶剂沉淀 • 3、吸附色谱法 • 4、多糖基离子交换色谱法； • 5、凝胶过滤分离； • 6、亲和色谱法 • 7、制备超离心分离； • 8、其它分离纯化方法以及 后期结晶
• • • • • • • • •
三、蛋白质的浓缩和脱盐 （一）、蛋白质的浓缩 1、沉淀法：中性盐或有机溶剂。 2、吸附法：如干葡聚糖凝胶G－25（或吸水 棒）。 3、超滤法： 4、减压蒸馏法： 5、冷冻干燥法： 6、离子交换层析法 7、有机聚合物干燥法 聚乙二醇等聚合物进 行干燥。
• 七、红外线干燥 • 利用红外线辐射作为热源,向湿物料供热。 • 八、微波干燥 • 在微波电磁场的作用下,使物料内部的极 性分子产生振动,振动的能量使被干燥物 料发热,从而达到水分汽化除去的目的。 目前微波干燥技术在食品工业中已经应 用。 • 九、高压静电干燥 • 利用高压电晕电场对物料进行脱水干燥。
10、一个蛋白质的提取物，SDSPAGE后发现有多条带，试分析可能 原因。
11、欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75％，需加入饱和 硫酸铵多少？
12.某一蛋白经SDS-PAGE后在标准蛋白的13000～36000D间出 现了一条带，加入巯基乙醇和碘乙酸处理后，发现SDS-PAGE后 仍然为一条带，且带的位置在13100D处，试推断一下该蛋白的可 能结构。（碘乙酸可以结合在巯基上） 13. 叙述从培养的细胞中提取纯化目的蛋白的基本程序。
2、微量双缩脲法： 此法显色原理与双缩脲法相同，在 310～330nm测定，干扰因素少。且比 540nm测定灵敏10倍以上。 因此可选用310nm进行比色测定，测 定范围为0.1～1.0mg/ml； 或用330nm测定，测定范围为0.2～ 2.0mg/ml。
• 二、Folin—酚试剂法(Lowry法) • 原理:在碱性条件下，蛋白质与碱性铜 溶液中的铜络合使得肽键伸展， • 暴露出的酪氨酸和色氨酸与磷钼钨酸反 应，产生深蓝色,500nm处比色。
• 三、紫外吸收法测定蛋白质含量 • 是利用物质在紫外光区（200～400nm） 特有的吸收光谱 • 1.280nm紫外吸收法 • 利用蛋白质在280nm有吸收峰进行测定 • 需同样条件爱下制作标准曲线。 • 准确性较差。
• 2．280nm和260nm处的吸收差法 • 由于有核酸的干扰，可利用280nm和260nm 处的吸收差求： • 蛋白质的浓度（g/L或mg/ml） =(1.45A280nm- 0.74A260nm）×稀释倍数 • 3．215nm和225nm的吸收差法
• 纯蛋白质：N—末端氨基酸 • 总的氨基酸分析
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• 五、超速离心沉降分析法 • 脂蛋白和膜束缚的蛋白质最好用超速离心法。 • 在离心管中若出现明显的分界线，或者分部 取出离心管中的样品，管号对样品浓度作图， 若组分的分布是对称的，则表明样品是均一 的。 • 六、其它方法 • 纯蛋白质的OD280/OD260的值应为1.75。 • 污染蛋白质生物活力的消失也是一个间接的 纯度评价标准。 • 利用蛋白质的特殊功能特性(如激素、酶、氧 载体等)检验纯度。
练 习 与 思 考
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•
1、蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？ 2、蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项。 3、举例说明沉淀分离蛋白质的方法。 4、蛋白质含量测定的方法有哪几种?原理如何? 5、蛋白质纯度鉴定的方法有哪几种？ 6、蛋白质结晶的方法有哪几种？ 7、蛋白质干燥的方法有哪几种？ 8、某学生分离提取得到某一个酶，测定其活 性发现没有活性，分析其可能原因。 9、向一蛋白质溶液中加入有机溶剂，该蛋白 沉淀下来，该蛋白的活性是否受到影响？为什 么？ 10、一个蛋白质的提取物，SDS-PAGE后发现有 多条带，试分析可能原因。 11、欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75 ％，需加入饱和硫酸铵多少？
• （二）、蛋白质的脱盐 • 常用的脱盐方法： • 透析法 • 超滤法 • 分子筛层析法
第三节 蛋白质的含量测定
• 一、双缩脲法 • 1、常量双缩脲法： • 早期阶段的测定非常 有用。 • 双缩脲法的原理是铜 离子与蛋白质的肽键 结合，形成紫红色络 合物，此物质在 540nm处有最大吸收， 可以比色测定， • 此法常用于 0.5mg/mL-10mg/ml蛋 白质溶液的测定。
(1) 在樣本溶液中直接溶入 CsCl， 经离心 后自動形成梯度。 • (2) 使用梯度制造器，在離心管內預先制 好甘油 或 蔗糖 的梯度，加 样品后离心。
第五节 蛋白质的结晶
• 一、结晶原理 • 当蛋白质溶液达到过饱和状态时会结晶。 • 许多性质相同的粒子在三维空间有规律地排 列成格子状固体，称为晶体。晶体具有方向 性，具有一定对称性。 • 晶体内部有规律的结构，决定了晶体的形成 必须是相同的离子或分子，所以能形成晶体 的物质是比较纯的。 • 维持其基本水合状态，处于或接近生理pH和 温度。
第十章 蛋白质的分离与测定技术
(二)、蛋白质分离提取的一般步骤
• (1)材料的选择和预处理； • (2)破碎生物组织(原料是细胞外分泌物时无需此步)，并用 适当的缓冲液将蛋白质提取出来； • ⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开； • (4)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来； • (5)进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开； • (6) 结晶或制成冻干粉。
(6) 离心法：超速离心法
• 蛋白質分子在 离心時，其 分 子量、分子密度、組成、形狀 等，均会影响其沉降速度。 • 沉降系數 ：单位离心力场下 的沉降速度 其 单位 为 S (Svedberg unit)， 不同蛋白 質的沉降 系數不同，可利用超 高速离心法，在密度梯度中作 分离。
密度梯度的准备
• 肽键在230nm以下有强吸收，波长越短，光吸 收越强.用215nm和225nm光吸收差值与单一波 长测定相比，可减少非蛋白成分引起的误差。 • 蛋白质的质量浓度（g/L或mg/ml） =0.144(A215nm- 0.74A225nm）
• 四、考马斯亮蓝染色法（Brodford法） • 蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝G— 250结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色 由棕红色变为蓝色），从465nm变为595nm处 的光吸收值增加，即可进行定量。 • 五、凯氏定氮法 • 被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨，氨和 硫酸结合生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下 分解产生氨。用水蒸气蒸馏法将氨收集于过 量的硼酸中，然后用标准酸溶液滴定。根据 所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约 为6.25％，计算样品的蛋白质含量。
• • • • • • •
1、蛋白质纯度 2、蛋白质浓度 3、溶剂的选择 4、温度 5、pH值 6、结晶时间 7、金属离子和离子强 度 • 8、晶种 • 9、搅拌
三、结晶方法 盐析法 有机溶剂法 等电点结晶 温差结晶 脱盐结晶 金属离子
第六节 干 燥
• 干燥是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液 体中的水或溶剂除尽的过程。 • 一、影响干燥的因素 • (一)蒸发面积 • (二)干燥速度 • (三）物料所处的状态 • (四)温度 • (五)湿度 • （六)压力
• 二、通过层析性质的检测 • 各分级组分的比活力应当恒定，则得到的组 分是均一的。 • 三、免疫化学法 • 免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射 免疫、酶标免疫分析、发光免疫分析和 Western blotting等。 • 四、蛋白质化学结构分析法
• 蛋白质结晶即在一定的溶剂条件下，降低分 散相的溶解度，使溶质处于过饱和状态，此 时溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形 式形成晶核，然后溶质分子再以相互对撞的 方式有序而反复地堆砌到晶核上。于是晶核 长大，晶体形成。 • 二、结晶条件 • 物质能否结晶主要决定于物质的本性，但具 有结晶能力的物质进行结晶时还必须具备一 定条件，即样品的纯度、溶液的饱和度和溶 剂的性质等三个主要条件，
第四节 蛋白质的纯度标准
• 一、电泳法 • 如果样品在凝胶电脉上显示一条区带，说明样品在其荷 质比方面是均一的。 • 不同pH下电泳，出现一条区带，说明样品的分子量是均一的， 因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。 • 等电聚焦电泳 如果只出现一条区带，那么足以证明此蛋白 质为均一蛋白质 • 脲的凝胶电泳用于鉴定在低离子强度下难溶的蛋白质纯度。 • 双向电泳
• 三、冷冻干燥 • 冷冻干燥(Lyophilization)，是先 将溶液或混悬液冷冻成固态，然后 在低温和高真空度下使冰升华，留 下干物。 • 四、真空干燥 • 五、喷 雾 干 燥 • 将料液(含水50%)喷成雾滴分散于热 气流中 • 六、滚筒干燥 • 将已经蒸发至相当稠度的液体在加 热面展成薄层进行干燥。
• 二、常压吸收干燥 • 常压干燥是在密闭空间内用干燥剂吸收水或 溶剂。此法的关键是选用合适的干燥剂。 • 1．干燥剂分类 按照脱水方式可以分为三 类: • (1)能够与水可逆地结合为水合物。 • 如无水氯化钙。 • (2)能够与水作用生成新的化合物， • 如五氧化二磷、氧化钙等。 • (3)能够吸去微量的水及溶剂， • 如分子筛。
蛋白质分离纯化方法：
• • • • • • 溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法 分配系数不同：如分配层析法 吸附性不同：如吸附层析法 在电场中运动速度不同：如电泳法 沉降系数或密度不同：如离心法 分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE 法 • 生物学特性不同：如亲和层析法 • 以上提取纯化方法的适当结合，在多数情况 下，足以获得纯化的蛋白质。
（三）提取后的进一步纯化
• 1、选择性变性沉淀除去杂质； • 2、分段盐析及有机溶剂沉淀 • 3、吸附色谱法 • 4、多糖基离子交换色谱法； • 5、凝胶过滤分离； • 6、亲和色谱法 • 7、制备超离心分离； • 8、其它分离纯化方法以及 后期结晶
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三、蛋白质的浓缩和脱盐 （一）、蛋白质的浓缩 1、沉淀法：中性盐或有机溶剂。 2、吸附法：如干葡聚糖凝胶G－25（或吸水 棒）。 3、超滤法： 4、减压蒸馏法： 5、冷冻干燥法： 6、离子交换层析法 7、有机聚合物干燥法 聚乙二醇等聚合物进 行干燥。
• 七、红外线干燥 • 利用红外线辐射作为热源,向湿物料供热。 • 八、微波干燥 • 在微波电磁场的作用下,使物料内部的极 性分子产生振动,振动的能量使被干燥物 料发热,从而达到水分汽化除去的目的。 目前微波干燥技术在食品工业中已经应 用。 • 九、高压静电干燥 • 利用高压电晕电场对物料进行脱水干燥。
10、一个蛋白质的提取物，SDSPAGE后发现有多条带，试分析可能 原因。
11、欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75％，需加入饱和 硫酸铵多少？
12.某一蛋白经SDS-PAGE后在标准蛋白的13000～36000D间出 现了一条带，加入巯基乙醇和碘乙酸处理后，发现SDS-PAGE后 仍然为一条带，且带的位置在13100D处，试推断一下该蛋白的可 能结构。（碘乙酸可以结合在巯基上） 13. 叙述从培养的细胞中提取纯化目的蛋白的基本程序。
2、微量双缩脲法： 此法显色原理与双缩脲法相同，在 310～330nm测定，干扰因素少。且比 540nm测定灵敏10倍以上。 因此可选用310nm进行比色测定，测 定范围为0.1～1.0mg/ml； 或用330nm测定，测定范围为0.2～ 2.0mg/ml。
• 二、Folin—酚试剂法(Lowry法) • 原理:在碱性条件下，蛋白质与碱性铜 溶液中的铜络合使得肽键伸展， • 暴露出的酪氨酸和色氨酸与磷钼钨酸反 应，产生深蓝色,500nm处比色。
• 三、紫外吸收法测定蛋白质含量 • 是利用物质在紫外光区（200～400nm） 特有的吸收光谱 • 1.280nm紫外吸收法 • 利用蛋白质在280nm有吸收峰进行测定 • 需同样条件爱下制作标准曲线。 • 准确性较差。
• 2．280nm和260nm处的吸收差法 • 由于有核酸的干扰，可利用280nm和260nm 处的吸收差求： • 蛋白质的浓度（g/L或mg/ml） =(1.45A280nm- 0.74A260nm）×稀释倍数 • 3．215nm和225nm的吸收差法
• 纯蛋白质：N—末端氨基酸 • 总的氨基酸分析
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• 五、超速离心沉降分析法 • 脂蛋白和膜束缚的蛋白质最好用超速离心法。 • 在离心管中若出现明显的分界线，或者分部 取出离心管中的样品，管号对样品浓度作图， 若组分的分布是对称的，则表明样品是均一 的。 • 六、其它方法 • 纯蛋白质的OD280/OD260的值应为1.75。 • 污染蛋白质生物活力的消失也是一个间接的 纯度评价标准。 • 利用蛋白质的特殊功能特性(如激素、酶、氧 载体等)检验纯度。
练 习 与 思 考
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1、蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？ 2、蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项。 3、举例说明沉淀分离蛋白质的方法。 4、蛋白质含量测定的方法有哪几种?原理如何? 5、蛋白质纯度鉴定的方法有哪几种？ 6、蛋白质结晶的方法有哪几种？ 7、蛋白质干燥的方法有哪几种？ 8、某学生分离提取得到某一个酶，测定其活 性发现没有活性，分析其可能原因。 9、向一蛋白质溶液中加入有机溶剂，该蛋白 沉淀下来，该蛋白的活性是否受到影响？为什 么？ 10、一个蛋白质的提取物，SDS-PAGE后发现有 多条带，试分析可能原因。 11、欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75 ％，需加入饱和硫酸铵多少？
• （二）、蛋白质的脱盐 • 常用的脱盐方法： • 透析法 • 超滤法 • 分子筛层析法
第三节 蛋白质的含量测定
• 一、双缩脲法 • 1、常量双缩脲法： • 早期阶段的测定非常 有用。 • 双缩脲法的原理是铜 离子与蛋白质的肽键 结合，形成紫红色络 合物，此物质在 540nm处有最大吸收， 可以比色测定， • 此法常用于 0.5mg/mL-10mg/ml蛋 白质溶液的测定。
(1) 在樣本溶液中直接溶入 CsCl， 经离心 后自動形成梯度。 • (2) 使用梯度制造器，在離心管內預先制 好甘油 或 蔗糖 的梯度，加 样品后离心。
第五节 蛋白质的结晶
• 一、结晶原理 • 当蛋白质溶液达到过饱和状态时会结晶。 • 许多性质相同的粒子在三维空间有规律地排 列成格子状固体，称为晶体。晶体具有方向 性，具有一定对称性。 • 晶体内部有规律的结构，决定了晶体的形成 必须是相同的离子或分子，所以能形成晶体 的物质是比较纯的。 • 维持其基本水合状态，处于或接近生理pH和 温度。
第十章 蛋白质的分离与测定技术
(二)、蛋白质分离提取的一般步骤
• (1)材料的选择和预处理； • (2)破碎生物组织(原料是细胞外分泌物时无需此步)，并用 适当的缓冲液将蛋白质提取出来； • ⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开； • (4)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来； • (5)进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开； • (6) 结晶或制成冻干粉。
(6) 离心法：超速离心法
• 蛋白質分子在 离心時，其 分 子量、分子密度、組成、形狀 等，均会影响其沉降速度。 • 沉降系數 ：单位离心力场下 的沉降速度 其 单位 为 S (Svedberg unit)， 不同蛋白 質的沉降 系數不同，可利用超 高速离心法，在密度梯度中作 分离。
密度梯度的准备
• 肽键在230nm以下有强吸收，波长越短，光吸 收越强.用215nm和225nm光吸收差值与单一波 长测定相比，可减少非蛋白成分引起的误差。 • 蛋白质的质量浓度（g/L或mg/ml） =0.144(A215nm- 0.74A225nm）
• 四、考马斯亮蓝染色法（Brodford法） • 蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝G— 250结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色 由棕红色变为蓝色），从465nm变为595nm处 的光吸收值增加，即可进行定量。 • 五、凯氏定氮法 • 被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨，氨和 硫酸结合生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下 分解产生氨。用水蒸气蒸馏法将氨收集于过 量的硼酸中，然后用标准酸溶液滴定。根据 所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约 为6.25％，计算样品的蛋白质含量。
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1、蛋白质纯度 2、蛋白质浓度 3、溶剂的选择 4、温度 5、pH值 6、结晶时间 7、金属离子和离子强 度 • 8、晶种 • 9、搅拌
三、结晶方法 盐析法 有机溶剂法 等电点结晶 温差结晶 脱盐结晶 金属离子
第六节 干 燥
• 干燥是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液 体中的水或溶剂除尽的过程。 • 一、影响干燥的因素 • (一)蒸发面积 • (二)干燥速度 • (三）物料所处的状态 • (四)温度 • (五)湿度 • （六)压力