蛋白质组学总结
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第一章
功能基因组与蛋白质组
蛋白质组学诞生的背景
基因组的局限性
全方位蛋白质研究的迫切要求 医药研究开发的巨大需求 高通量分离、鉴定技术的出现 计算机信息科学的有力支持
蛋白质组学
§4 蛋白质组的基本知识 1、概念 蛋白质组（proteome）： 一种基因组所能表达的全套蛋白质； 一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合；
除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术：
多维色谱与质谱联用：大规模蛋白质分离与鉴定 同位素编码亲和序列标签技术（ICAT）：简化样本、 定量。 酵母双杂交技术和免疫共沉淀（ CoIP）：蛋白质间相
互作用
§2 大规模的蛋白质提取、分离技术
二、色谱—质谱技术 弥补以2-DE/MS 为基础的蛋白质组技术方法的不足。 1、二维色谱—串联质谱技术（2D-HPLC-MS-MS） 主要特点：快速（ 1-2 小时）；易于和质谱连用（液相系 统，避免胶上回收） ；适用于各种蛋白质的分离（疏水
连接部分（重链或轻链） X代表8个氢或者氘原子
巯基特异反应基团 与蛋白中Cys的-SH连接
首先，对蛋白质进行标记。 接下来，蛋白酶切 — 形成多肽混合物。 然后再使用亲和色谱分离 —— 只有标记肽段被保留 （先洗脱下未标记肽段，再改变洗脱条件，洗脱下别标记 肽段）。这样，使样品变得简单。 比较标记了重链和轻链的肽段在质谱图中的信号强度， 这样，可以实现对差异蛋白质的定量分析。
重要信息；18O从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。
常用酶类
要 求： 水解为点专一； 切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索；
酶自身稳定，不易降解。
常用酶类：
胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶等。
§3 液相色谱—电喷雾—串联质谱 一、电喷雾电离源的工作原理 利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在 N2气流作用下： 液滴溶剂蒸发——表面积减小——表面电荷密度不断 增加——库伦斥力与表面张力达到雷利极限 ——液滴爆裂 为带电的子液滴； 这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，
pI大于pH7
+ pH 4.0
——
——
pH7.0 + pH 7.0
pH 9.0
+
pH 4.0
— pH 9.0
+
pH 4.0 pH 7.0 pH 9.0
—
实现聚焦
IPG胶条的平衡 在第一向等点聚焦电泳结束之后，第二向电泳进行之 前，必须对胶条进行平衡。 平衡第一步的作用是让蛋白变性，当SDS单体浓度高 于1 mmol/L时，与蛋白定量结合(1g蛋白/1.4g SDS)，掩盖 蛋白所带电荷，并使构象均呈 雪茄装。 平衡的第二步是以碘乙酰胺 代替第一步中使用的DTT， 否则DTT会影响SDS-PAGE 的电泳效果。
C-ICAT
酶切
C-ICAT
C-ICAT
C-ICAT
亲和分离
C -ICAT C -ICAT
质谱分析
C-ICAT
C -ICAT
第三章 双向电泳的蛋白质 提取与样品制备
§1 细胞裂解的方法 一、温和的裂解方法 用于比较简单的样品： 组织培养的细胞，血细胞、微生物或细胞器。 1）渗透裂解：低渗溶液悬浮细胞。
行时间质谱( MALDI-TOF-MS)。
激光
+ 离子源 Uacc
+
+
+
高真空无场飞行管
检测器
线形 MALDI-TOF 原理图
脉冲激光使样本离子化，在外加电场作用下获得动能，
进入高真空无电场飞行管道，以在加速电场内获得的速度
飞行。 质量较小的离子飞行速度快，到达检测器早；质量较 大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。
品分子电离
特点之一：
产生的离子多为单电荷离子—— 谱峰与样品各组分的
质量数又一一对应关系，所以 MALDI 最适宜分析多肽及
蛋白混合物。
基质为小分子有机酸及其衍生物，由于：
极性化合物 芳环
溶解样品 吸收激光
易结晶
均匀分散样品分子
二、线形飞行时间质量检测器 MALDI离子源通常用飞行时间 (time of flight, TOF) 检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸电离飞
表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离
子形式进入质量分析器。
电喷雾电离产生多电荷离子：
可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将 质谱仪的质量范围放大的n倍。
在高pH条件下，蛋白质所带电荷为负。
在某一 pH 条件下，蛋白质所带净电荷为零时；则此 pH为该蛋白的等电点 (pI)。 蛋白质的等电点取决于蛋白质的氨基酸组成，是蛋白质
的一个物理化学常数，可以据此特性分离蛋白质。
据此，设计含有pH梯度的凝胶，在外加电场作用下，
蛋白质向与它的等电点一致的pH处泳动，直至聚焦于该处。
2 ）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min) ，随后在
37℃ 融化(1-2 min) ，反复几次。
3 ）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲 液重悬细胞。 4 ）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。 等渗缓冲液含有某种酶：
溶菌酶（lysozyme）—— 细菌
纤维素酶（ cellulase ）和果胶酶（ pectinase ） —— 植 物细胞 溶细胞酶 (lyticase)—— 酵母细胞 上述方法有时可以联合运用，裂解效果更好。
Tags， ICAT），可以简化样本，并有定量作用。ICAT试
剂由三部分组成： ①活性基团，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基； ②连接子，用于结合稳定的同位素； ③生物素，作为亲和标签，能与卵白素结合，用于选择分 离标记的多肽。（卵白素可结合在固相支持介质。）
ICAT试剂由三部分组成：
生物素 用于被标记多肽的亲和纯化
如有可能，可加入强变性剂：
8 mol/L 尿素、 10% TCA 或 2% SDS。
但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以 需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
四、通过沉淀分离蛋白 分离策略： 沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白 质。 附带作用： 浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。 注意： 某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。
性蛋白、偏酸偏减性蛋白、过大过小的蛋白）。
二维色谱有多种组合模式：第一维常用离子交换色谱
或凝胶过滤色谱。第二维常用反相色谱。
2、同位素—亲和标记—质谱技术（ICAT） 细胞中蛋白质数目巨大，酶切后的多肽混合物十分复 杂，现有的2-DE和2D-HPLC都难以完全分离。1999年Gygi 等人发明同位素亲和标签技术 （ Isotope Coded Affinity
一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状
态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。
2、技术路线与相关技术
技术路线
蛋白提取 样品 酶切消化 蛋白混合物
双向电泳 蛋白图谱 肽段 数据库 酶切消化
肽段混合物 双向电泳
质谱分析 数据库检索 质谱数据
第二章 蛋白质组研究方法
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。 生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。 计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
完成2-DE后，凝胶图像要扫描保存，以数字化图像的 形式储存起来。工作步骤： 1、蛋白质点检测 2、背景消减——扣除背景染 色对蛋白丰度计算的影响。 3 、归一化处理 —— 使不同胶上同一蛋白质点准确地相对 定量，进行比较。 4、蛋白质点匹配
第六章 生物质谱技术与
蛋白质鉴定
质谱 （Mass Spectrometry, MS）
§2 SDS—PAGE原理
在电场的作用下，带电粒子能在凝胶中迁移，迁移速
度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。
SDS 是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间
以及其它物质分子之间的非共价键，所以可使寡聚体解聚
成亚基；在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下， 蛋白质分子内的二硫键被打开。这样，解聚后的多肽分子 与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS 复合物，其所 带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了
§2 肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术 肽质量指纹谱 (peptide mass fingerprinting, PMF)是指
蛋白被酶切位点专一的蛋白酶水解后，得到的肽片段质量
图谱。由于所产生的肽段具有特定序列、长度，因而具有 特定的质量，且 产生的片段数目 亦有特异性，故 称指纹谱。
为什么要酶切蛋白样品？
第四章
原 理
双向电泳与蛋白质分离
利用了蛋白的两个特性对其进行分离。
第一向
等点聚焦电泳——利用蛋白的等点电进行分离 第二向 SDS—PAGE ——利用蛋白的相对分子量分离
§1 等点聚焦电泳原理
构成蛋白质的氨基酸是两性电解质，决定了蛋白质 的在一定的pH 条件下带有电荷。 在低pH条件下，蛋白质所带电荷为正；
§3 胶上蛋白检测
一、考马斯亮蓝染色
特点：简单、无毒性、对比度好、与下游蛋白鉴定方法兼
容。
缺点：检出限10 ng、修饰谷氨酸侧链，费时（24-48h）
二、银染
特点：灵敏度200 pg。
缺点：醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难。
先银染，再加大上样量进行2-DE，考染，质谱鉴定。
第五章 图像分析与细胞蛋白谱的建立
特殊的天平：称量离子的质量
离子源
质量分析器
检测器
依据不同方式将样品离子按质荷比 m／z分开
§1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
一、MALDI 离子源
原理 分析物分散于基质中，形成晶体
激光束辐射到基质和样品分子上
基质吸收激光束能量后汽化，部分 样品分子伴随基质的汽化而解吸， 基质与样品之间发生电荷转移，样
不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。所带电荷多少与分
子大小呈正比（即各种蛋白亚基的荷质比基本一致）。
再者，多肽 -SDS 复合物在溶液中的形状像一个长椭圆 棒，不同的蛋白质亚基 -SDS复合物所形成的椭圆棒的短轴
基本上相同，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正
比。 因此，这种复合物在 SDS-PAGE 系统中的电泳迁移率 不再受蛋白质原有电荷与构型的影响，而主要取决于椭圆 棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质 的分子量在 15-200kD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数 呈线性关系。
蛋白分子往往有许多的修饰位点，而且这些修饰未必
均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。
但如果进行酶切后，产生了多条肽段，其中有些肽段 是没有修饰位点或未被修饰的，其质量信息，能准确反应 肽段的氨基酸构成情况，在数据库中查找、比对时，便可 知这类肽段源于何种蛋白，进而确定样品是何种蛋白。这 是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。 此外，酶切产生肽段数目固定，是肽质量指纹图谱的
起来，得到高分wenku.baidu.com率的2-DE图谱。
具体步骤： 第一步——以水溶液提取（只溶解偏亲水性蛋白）。 第二步 ——以含 Urea/CHAPS/DTT的溶液提取（传统裂解， 溶解亲水性、中性和疏水性蛋白）。 第三步 —— 以含硫脲 /SB3-10/TBP 的溶液提取（主要溶解 疏水性蛋白）。 有实验表明，11个大肠杆菌的膜蛋白在第三步提取出 来。
沉淀方法 1）硫酸铵沉淀（盐析）。 2）TCA沉淀（三氯乙酸沉淀）。 3）丙酮沉淀 。 4）在冰丙酮中用TCA沉淀。 5）苯酚提取，然后在甲醇中用醋酸铵沉淀。
五、清除影响二维电泳图谱的杂质 一方面，沉淀分离蛋白，另一方面除去杂质： 1）盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子。 2）内源性小分子。 3）离子去污剂。裂解液中的SDS会影响第一向电泳，需以 含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液（或重泡涨 液）将 SDS 稀释至终浓度低于 0.25% ，或其它去污剂与 SDS的比率为8:1。亦可用丙酮沉淀方法去除SDS。 4）核酸（DNA, RNA）
使用DNase和RNase A混合处理样品。
§2 蛋白质的分步提取技术 硫脲、sulfobetaine和 TBP 可极大提高样品的溶解度， 联合运用硫脲、表面活性剂 SB3-10 和 TBP ，可构成高效 IEF裂解液，溶解传统方法难以溶解的蛋白。
1998 年， Molloy 把分步提取法和高效裂解缓冲液联合
二、剧烈的裂解方法 用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有 坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。 1）超声裂解法。 2）弗氏压碎法。 3）研磨法。 4）机械匀浆法。 5）玻璃珠匀浆法。
三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。
蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。
功能基因组与蛋白质组
蛋白质组学诞生的背景
基因组的局限性
全方位蛋白质研究的迫切要求 医药研究开发的巨大需求 高通量分离、鉴定技术的出现 计算机信息科学的有力支持
蛋白质组学
§4 蛋白质组的基本知识 1、概念 蛋白质组（proteome）： 一种基因组所能表达的全套蛋白质； 一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合；
除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术：
多维色谱与质谱联用：大规模蛋白质分离与鉴定 同位素编码亲和序列标签技术（ICAT）：简化样本、 定量。 酵母双杂交技术和免疫共沉淀（ CoIP）：蛋白质间相
互作用
§2 大规模的蛋白质提取、分离技术
二、色谱—质谱技术 弥补以2-DE/MS 为基础的蛋白质组技术方法的不足。 1、二维色谱—串联质谱技术（2D-HPLC-MS-MS） 主要特点：快速（ 1-2 小时）；易于和质谱连用（液相系 统，避免胶上回收） ；适用于各种蛋白质的分离（疏水
连接部分（重链或轻链） X代表8个氢或者氘原子
巯基特异反应基团 与蛋白中Cys的-SH连接
首先，对蛋白质进行标记。 接下来，蛋白酶切 — 形成多肽混合物。 然后再使用亲和色谱分离 —— 只有标记肽段被保留 （先洗脱下未标记肽段，再改变洗脱条件，洗脱下别标记 肽段）。这样，使样品变得简单。 比较标记了重链和轻链的肽段在质谱图中的信号强度， 这样，可以实现对差异蛋白质的定量分析。
重要信息；18O从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。
常用酶类
要 求： 水解为点专一； 切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索；
酶自身稳定，不易降解。
常用酶类：
胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶等。
§3 液相色谱—电喷雾—串联质谱 一、电喷雾电离源的工作原理 利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在 N2气流作用下： 液滴溶剂蒸发——表面积减小——表面电荷密度不断 增加——库伦斥力与表面张力达到雷利极限 ——液滴爆裂 为带电的子液滴； 这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，
pI大于pH7
+ pH 4.0
——
——
pH7.0 + pH 7.0
pH 9.0
+
pH 4.0
— pH 9.0
+
pH 4.0 pH 7.0 pH 9.0
—
实现聚焦
IPG胶条的平衡 在第一向等点聚焦电泳结束之后，第二向电泳进行之 前，必须对胶条进行平衡。 平衡第一步的作用是让蛋白变性，当SDS单体浓度高 于1 mmol/L时，与蛋白定量结合(1g蛋白/1.4g SDS)，掩盖 蛋白所带电荷，并使构象均呈 雪茄装。 平衡的第二步是以碘乙酰胺 代替第一步中使用的DTT， 否则DTT会影响SDS-PAGE 的电泳效果。
C-ICAT
酶切
C-ICAT
C-ICAT
C-ICAT
亲和分离
C -ICAT C -ICAT
质谱分析
C-ICAT
C -ICAT
第三章 双向电泳的蛋白质 提取与样品制备
§1 细胞裂解的方法 一、温和的裂解方法 用于比较简单的样品： 组织培养的细胞，血细胞、微生物或细胞器。 1）渗透裂解：低渗溶液悬浮细胞。
行时间质谱( MALDI-TOF-MS)。
激光
+ 离子源 Uacc
+
+
+
高真空无场飞行管
检测器
线形 MALDI-TOF 原理图
脉冲激光使样本离子化，在外加电场作用下获得动能，
进入高真空无电场飞行管道，以在加速电场内获得的速度
飞行。 质量较小的离子飞行速度快，到达检测器早；质量较 大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。
品分子电离
特点之一：
产生的离子多为单电荷离子—— 谱峰与样品各组分的
质量数又一一对应关系，所以 MALDI 最适宜分析多肽及
蛋白混合物。
基质为小分子有机酸及其衍生物，由于：
极性化合物 芳环
溶解样品 吸收激光
易结晶
均匀分散样品分子
二、线形飞行时间质量检测器 MALDI离子源通常用飞行时间 (time of flight, TOF) 检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸电离飞
表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离
子形式进入质量分析器。
电喷雾电离产生多电荷离子：
可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将 质谱仪的质量范围放大的n倍。
在高pH条件下，蛋白质所带电荷为负。
在某一 pH 条件下，蛋白质所带净电荷为零时；则此 pH为该蛋白的等电点 (pI)。 蛋白质的等电点取决于蛋白质的氨基酸组成，是蛋白质
的一个物理化学常数，可以据此特性分离蛋白质。
据此，设计含有pH梯度的凝胶，在外加电场作用下，
蛋白质向与它的等电点一致的pH处泳动，直至聚焦于该处。
2 ）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min) ，随后在
37℃ 融化(1-2 min) ，反复几次。
3 ）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲 液重悬细胞。 4 ）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。 等渗缓冲液含有某种酶：
溶菌酶（lysozyme）—— 细菌
纤维素酶（ cellulase ）和果胶酶（ pectinase ） —— 植 物细胞 溶细胞酶 (lyticase)—— 酵母细胞 上述方法有时可以联合运用，裂解效果更好。
Tags， ICAT），可以简化样本，并有定量作用。ICAT试
剂由三部分组成： ①活性基团，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基； ②连接子，用于结合稳定的同位素； ③生物素，作为亲和标签，能与卵白素结合，用于选择分 离标记的多肽。（卵白素可结合在固相支持介质。）
ICAT试剂由三部分组成：
生物素 用于被标记多肽的亲和纯化
如有可能，可加入强变性剂：
8 mol/L 尿素、 10% TCA 或 2% SDS。
但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以 需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
四、通过沉淀分离蛋白 分离策略： 沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白 质。 附带作用： 浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。 注意： 某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。
性蛋白、偏酸偏减性蛋白、过大过小的蛋白）。
二维色谱有多种组合模式：第一维常用离子交换色谱
或凝胶过滤色谱。第二维常用反相色谱。
2、同位素—亲和标记—质谱技术（ICAT） 细胞中蛋白质数目巨大，酶切后的多肽混合物十分复 杂，现有的2-DE和2D-HPLC都难以完全分离。1999年Gygi 等人发明同位素亲和标签技术 （ Isotope Coded Affinity
一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状
态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。
2、技术路线与相关技术
技术路线
蛋白提取 样品 酶切消化 蛋白混合物
双向电泳 蛋白图谱 肽段 数据库 酶切消化
肽段混合物 双向电泳
质谱分析 数据库检索 质谱数据
第二章 蛋白质组研究方法
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。 生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。 计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
完成2-DE后，凝胶图像要扫描保存，以数字化图像的 形式储存起来。工作步骤： 1、蛋白质点检测 2、背景消减——扣除背景染 色对蛋白丰度计算的影响。 3 、归一化处理 —— 使不同胶上同一蛋白质点准确地相对 定量，进行比较。 4、蛋白质点匹配
第六章 生物质谱技术与
蛋白质鉴定
质谱 （Mass Spectrometry, MS）
§2 SDS—PAGE原理
在电场的作用下，带电粒子能在凝胶中迁移，迁移速
度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。
SDS 是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间
以及其它物质分子之间的非共价键，所以可使寡聚体解聚
成亚基；在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下， 蛋白质分子内的二硫键被打开。这样，解聚后的多肽分子 与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS 复合物，其所 带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了
§2 肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术 肽质量指纹谱 (peptide mass fingerprinting, PMF)是指
蛋白被酶切位点专一的蛋白酶水解后，得到的肽片段质量
图谱。由于所产生的肽段具有特定序列、长度，因而具有 特定的质量，且 产生的片段数目 亦有特异性，故 称指纹谱。
为什么要酶切蛋白样品？
第四章
原 理
双向电泳与蛋白质分离
利用了蛋白的两个特性对其进行分离。
第一向
等点聚焦电泳——利用蛋白的等点电进行分离 第二向 SDS—PAGE ——利用蛋白的相对分子量分离
§1 等点聚焦电泳原理
构成蛋白质的氨基酸是两性电解质，决定了蛋白质 的在一定的pH 条件下带有电荷。 在低pH条件下，蛋白质所带电荷为正；
§3 胶上蛋白检测
一、考马斯亮蓝染色
特点：简单、无毒性、对比度好、与下游蛋白鉴定方法兼
容。
缺点：检出限10 ng、修饰谷氨酸侧链，费时（24-48h）
二、银染
特点：灵敏度200 pg。
缺点：醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难。
先银染，再加大上样量进行2-DE，考染，质谱鉴定。
第五章 图像分析与细胞蛋白谱的建立
特殊的天平：称量离子的质量
离子源
质量分析器
检测器
依据不同方式将样品离子按质荷比 m／z分开
§1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
一、MALDI 离子源
原理 分析物分散于基质中，形成晶体
激光束辐射到基质和样品分子上
基质吸收激光束能量后汽化，部分 样品分子伴随基质的汽化而解吸， 基质与样品之间发生电荷转移，样
不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。所带电荷多少与分
子大小呈正比（即各种蛋白亚基的荷质比基本一致）。
再者，多肽 -SDS 复合物在溶液中的形状像一个长椭圆 棒，不同的蛋白质亚基 -SDS复合物所形成的椭圆棒的短轴
基本上相同，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正
比。 因此，这种复合物在 SDS-PAGE 系统中的电泳迁移率 不再受蛋白质原有电荷与构型的影响，而主要取决于椭圆 棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质 的分子量在 15-200kD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数 呈线性关系。
蛋白分子往往有许多的修饰位点，而且这些修饰未必
均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。
但如果进行酶切后，产生了多条肽段，其中有些肽段 是没有修饰位点或未被修饰的，其质量信息，能准确反应 肽段的氨基酸构成情况，在数据库中查找、比对时，便可 知这类肽段源于何种蛋白，进而确定样品是何种蛋白。这 是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。 此外，酶切产生肽段数目固定，是肽质量指纹图谱的
起来，得到高分wenku.baidu.com率的2-DE图谱。
具体步骤： 第一步——以水溶液提取（只溶解偏亲水性蛋白）。 第二步 ——以含 Urea/CHAPS/DTT的溶液提取（传统裂解， 溶解亲水性、中性和疏水性蛋白）。 第三步 —— 以含硫脲 /SB3-10/TBP 的溶液提取（主要溶解 疏水性蛋白）。 有实验表明，11个大肠杆菌的膜蛋白在第三步提取出 来。
沉淀方法 1）硫酸铵沉淀（盐析）。 2）TCA沉淀（三氯乙酸沉淀）。 3）丙酮沉淀 。 4）在冰丙酮中用TCA沉淀。 5）苯酚提取，然后在甲醇中用醋酸铵沉淀。
五、清除影响二维电泳图谱的杂质 一方面，沉淀分离蛋白，另一方面除去杂质： 1）盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子。 2）内源性小分子。 3）离子去污剂。裂解液中的SDS会影响第一向电泳，需以 含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液（或重泡涨 液）将 SDS 稀释至终浓度低于 0.25% ，或其它去污剂与 SDS的比率为8:1。亦可用丙酮沉淀方法去除SDS。 4）核酸（DNA, RNA）
使用DNase和RNase A混合处理样品。
§2 蛋白质的分步提取技术 硫脲、sulfobetaine和 TBP 可极大提高样品的溶解度， 联合运用硫脲、表面活性剂 SB3-10 和 TBP ，可构成高效 IEF裂解液，溶解传统方法难以溶解的蛋白。
1998 年， Molloy 把分步提取法和高效裂解缓冲液联合
二、剧烈的裂解方法 用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有 坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。 1）超声裂解法。 2）弗氏压碎法。 3）研磨法。 4）机械匀浆法。 5）玻璃珠匀浆法。
三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。
蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。