人类胚胎干细胞基础培训教材1130

人类胚胎干细胞基础技术

高级培训班

2010-12

目录

1. 绪论 (3)

2. 饲养层细胞的制备 (4)

2.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） (4)

2.2 MEF的传代 (5)

2.3 MEF的冻存 (5)

2.4 MEF的失活 (6)

3. 饲养层细胞的准备 (7)

4. ES/iPS细胞的复苏 (9)

5. ES/iPS细胞的传代 (10)

6. ES/iPS细胞的冻存 (12)

7. 人类胚胎干细胞的无滋养层培养 (13)

7.1 人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集 (13)

7.2 无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代 (13)

8. 拟胚体的形成 (14)

9. 胚胎干细胞全能性的鉴定 (15)

9.1碱性磷酸酶活性检测 (15)

9.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (16)

9.3干性因子的去甲基化程度分析 (17)

9.4干细胞内源基因的表达分析 (19)

9.5端粒酶活性检测 (21)

9.6核型检测 (21)

9.7拟胚体形成 (21)

9.8畸胎瘤形成实验 (22)

10. 干细胞技术培训及服务一览表 (23)

11. 附录 (24)

1.绪论

本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。

2.饲养层细胞的制备

材料与仪器

♦成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01

♦胰酶，货号M-005-1

♦成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01

♦基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235

♦CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01

♦T25透气培养瓶，NUNC，货号156367

♦T75透气培养瓶，NUNC，货号156499

♦ 2 ml移液管，NUNC，货号159617

♦5ml移液管，NUNC，货号159625

♦10 ml移液管，NUNC，货号159633

♦15ml离心管，货号366036

♦50ml离心管，货号373660

♦冻存管，NUNC，货号377267

♦Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头

♦生物安全柜，货号

♦CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i

♦电子计数器，millipore，货号PHCC00000

♦电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800

♦低速离心机，Thermo Scientific CL10

♦液氮罐，Thermofisher，货号CN50900

2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）

1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。

2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。

3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。

4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。

5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。

6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。

7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。

8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。

9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。

10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。

11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。

12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入0.25％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。

13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。

14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。

2.2MEF的传代

1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。

2. 加入大约3ml胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟

3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。确保瓶盖是拧紧的。用手掌根轻拍瓶侧3-5次。在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。

4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。▲Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。

5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。

6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。

7. 放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。

2.3MEF的冻存

1. 吸去培养液，加3ml0.25％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。

2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。