乳腺癌中β-catenin基因突变和表达的研究

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（１．ＴｈｅＦｉｒｓｔＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＣｈａｏｙａｎｇＣｏｕｎｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈａｏｙａｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ１２２０００；３．ｔｈｅＴｈｉｒｄＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ１１０００１，Ｃｈｉｎａ）ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｃａｔｅｎｉｎｇｅｎｅｉｎｂｒｅａｓｔｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｕｔａｔｉｏｎ β ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆβ ｃａｔｅｎｉｎｇｅｎｅｉｎ４２ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｒａｔｅｏｆａｂｎｏｒｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｔｅｎｉｎｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｓｅｗａｓ５９．５％（２５／４２）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｎｉｎｇｅｎｅｗａｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ β β ｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓＡｂｎｏｒｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆβ ｃａｔｅｎｉｎｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅ．Ｃｂｒｅａｓｔｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，ｂｕｔｔｈｅｃａｕｓｅｏｆａｂｎｏｒｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｔｅｎｉｎｉｓｎｏｔｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｎｉｎｇｅｎｅ． β β ［ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，２００７，１６（１）：５５－５７］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＢｒｅａｓｔＮｅｏｐｌａｓｍｓ／Ｐａｔｈｏｌ；β ｃａｔｅｎｉｎ；ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣＬＣｎｕｍｂｅｒｏｃｕｍｅｎｔｃｏｄｅ：Ｒ７３７．９；Ｒ７３－３Ｄ：Ａ
·基础研究·
乳腺癌中 β ｃａｔｅｎｉｎ基因突变和表达ห้องสมุดไป่ตู้研究
刘臻１，王贵友２，崔东旭１，刘宝林１，张小薄１，马文锋３，张强３
（１．中国医科大学附属第二医院普外一科，辽宁沈阳１１０００４；２．辽宁省朝阳县医院普外科，辽宁朝阳１２２０００；３．中国医科大学附属第一医院普外三科，辽宁沈阳１１０００１）摘要：目的探讨 β ｃａｔｅｎｉｎ（ｃａｔ）基因在乳腺癌发生中的作用。方法应用ＰＣＲＳＳＣＰ和免疫 β 组织化学法检测４２例乳腺癌组织中的 β ｃａｔ基因突变及表达。结果乳腺癌组织中 β ｃａｔ异常表达率为５９．５％（２５／４２）；但在其中未发现 β ｃａｔ基因突变。结论 β ｃａｔ异常表达在人乳腺癌发生过程中可能起重要作用，但该蛋白异常表达的原因并非是 β ｃａｔ基因突变。［中国普通外科杂志，２００７，１６（１）：５５－５７］关键词：乳腺肿瘤／病理学；β 连环素；基因表达中图分类号：Ｒ７３７．９；Ｒ７３－３文献标识码：Ａ
Ｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｔｅｎｉｎｇｅｎｅｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ β
１２１１１ＬＩＵＺｈｅｎ，ＷＡＮＧＧｕｉｙｏｕ，ＣＵＩＤｏｎｇｘｕ，ＬＩＵＢａｏｌｉｎ，ＺＨＡＮＧＸｉａｏｂｏ，３３ＭＡＷｅｎｆｅｎｇ，ＺＨＡＮＧＱｉａｎｇ
本研究检测了乳腺癌中 β ｃａｔ基因的表达及其外显子３的突变状况，试图了解 β ｃａｔ的表达和突变与乳腺癌发生的关系。
３例，髓样癌２例；ＴＮＭ分期：１例，９ Ⅰ期１ Ⅱ期１例，２例。所有病变均经病理证实。 Ⅲ期１
３］采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶定［
２结果
ｃａｔ免疫染色阳性物质呈棕黄色。癌旁正常 β 组织中，ｃａｔ定位于腺泡或导管上皮细胞膜上，尤 β 其是细胞－细胞间交界处，显示了细胞轮廓（图１）。４２例乳腺癌组织中，２５例 β ｃａｔ异常表达，异常率为５９．５％，表现为胞膜和胞质杂合性染色、胞膜染色减少或缺失、胞质内颗粒状染色（图２）。以癌旁正常组织作为对照，扩增产物均为密度一致的３条带。与癌旁正常组织相比，乳腺癌组织中未见异常电泳带（图３）。
１］研究［发现，乳腺癌中存在 β 连环
素（ｃａｔｅｎｉｎ，ｃａｔ）异常表达，这种异常表达与乳 β β
２］基因外显子３突变可能是其异常表达的原因［。
１资料和方法
．１标本及其一般资料腺癌的发生、发展有关。在某些肿瘤中发现，ｃａｔ１ β 标本取自本校附属第一医院２００３年１月 — ２００４年４月手术切除的４２例女性乳腺癌组织及距肿瘤５ｃｍ的癌旁正常乳腺组织。年龄３２～７５（平均５０．３±１０．５）岁；其中浸润性导管癌１９例，浸润性小叶癌１３例，导管内癌５例，黏液腺癌
第１６卷第１期２００７年１月
中国普通外科杂志ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ
Ｖｏｌ．１６Ｎｏ．１Ｊａｎ．２００７
文章编号：１００５－６９４７（２００７）０１－００５５－０３
收稿日期：２００６－０５－３１；修订日期：２００６－１０－２０。作者简介：刘臻，男，辽宁沈阳人，中国医科大学附属第二医院普外一科主治医师，主要从事乳腺癌临床与基础方面的研究。通讯作者：刘臻Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｚｈｅｎ７０９９＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
５６
中国普通外科杂志
２资料采用 χ 检验或Ｆｉｓｈｅｒ确切概率法。
第１６卷
１．２试剂与检测方法１．２．１主要试剂鼠抗人 β ｃａｔ单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司。蛋白酶Ｋ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰ混合液和 β ｃａｔ基因引物均购自大连宝生物有限公司。１．２．２免疫组织化学（免疫组化）染色及结果判
（ＳＰ）染色法检测乳腺癌和癌旁正常乳腺组织标本中 β ｃａｔ的表达。４ｍ组织切片脱蜡、水化， μ ３％过氧化氢室温孵育１０ｍｉｎ以封闭内源性过氧化物酶活性；高压抗原热修复；１０％非免疫血清室温孵育１０ｍｉｎ。滴加一抗，４ ℃ 过夜，加生物素标记的二抗，室温孵育２０ｍｉｎ；加ＳＰ试剂，室温孵育１０ｍｉｎ。ＤＡＢ染色，苏木精复染。用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）液代替一抗作阴性对照。以正常乳腺的腺泡及导管上皮细胞 β ｃａｔ的表达模式为阳性０％肿瘤细胞的染色强度和方式与正对照。如＞９常乳腺导管和腺泡上皮细胞染色相同，则为表达正常；如阳性染色的肿瘤细胞 ≤９０％，或存在细胞核染色以及细胞质内阳性颗粒聚集的肿瘤细胞，则为表达异常。１．２．３ β ｃａｔ基因外显子３突变的检测１．２．３．１基因组ＤＮＡ的制备采用酚－氯仿法抽提石蜡包埋组织中ＤＮＡ。１．２．３．２ β ｃａｔ基因外显子３引物引物１：５ ’ ＧＣＴＧＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＡ３ ’ ；引物２：５’ ＧＣＴＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＧＴＧＡＡ３’ ；扩增片段长度为２２７ｂｐ。１．２．３．３多聚酶链（ＰＣＲ）反应反应体系为２０Ｌ，包括１０×缓冲液２Ｌ，终浓度为 μ μ ０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｄＮＴＰ），Ｔａｑ酶２Ｕ，终浓度为２ｍｍｏｌ／Ｌ（ＭｇＣｌ２），引物各１２ｐｍｏｌ，模板３００ｎｇ。反应条件：９４ ℃，１０ｍｉｎ预变性；９４ ℃，变性１ｍｉｎ，５５ ℃，退火２ｍｉｎ，７２ ℃，延伸３ｍｉｎ；３５次循环。１．２．３．４单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ）取扩增产物１０Ｌ，加入变性上样液１０Ｌ（９５％去离子甲 μ μ 酰胺，２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＥＤＴＡ），０．０５％溴酚蓝，０．０５％二甲苯青）混合，９５ ℃ １０ｍｉｎ变性，冰浴１０ｍｉｎ，上样于６％非变性聚丙烯酰胺凝胶。电泳温度１６ ℃，电压３００Ｖ，电泳时间４．５ｈ。硝酸银染色。若出现与正常对照组织不同的单链泳动变位或额外带、电泳带缺失即为突变。１．３统计学处理采用ＳＰＳＳ１０．０软件进行统计学处理。计数