细胞工程动物细胞培养

第3章动物细胞培养
内容回顾
重点：细胞分化和细胞全能性
重点：消毒与灭菌方法、细胞培养的基本方法、支原体污染的检测与控制
3.1 动物细胞的特点
动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度高，结构、成分更复杂，功能更全面。

3.1.1动物细胞与微生物细胞的比较
（1）细胞大，无细胞壁；
（2）倍增时间长，生长缓慢，易受污染；
（3）需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感；
（4）以聚集体形式存在；
（5）原代细胞一般繁殖50代左右就退化死亡。

3.1.2动物细胞与植物细胞比较
共同点：动植物细胞中都有细胞膜、细胞质和细胞核。

区别：动物细胞中无细胞壁、叶绿体和液泡，但是有的植物细胞中无叶绿体。

3.1.3动物细胞连接的5种形式：
（1）紧密连接（常见）
（2）间隙连接（常见）
（3）隔壁连接（无脊椎动物细胞）
（4）中间连接（脊椎动物细胞）
（5）桥粒连接（常见）
***细胞连接（cell junction）：
细胞间的联系结构，是细胞质膜局部区域特化形成的，在结构上包括膜特化部分、质膜下的胞质部分及质膜外细胞间的部分。

细胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过细胞质膜相互联系, 协同作用的重要基础。

***各类连接的比较
3.2 动物细胞与组织培养的定义与分类
3.2.1定义：动物细胞与组织培养（animal cell and tissue culture) 是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

3.2.2分类
动物细胞与组织培养可以分为：细胞培养、组织培养和器官培养。

1. 细胞培养(cell culture):细胞培养是指细胞的体外培养,这是在无菌条件下,将机体内的组
织取出,分散(机械或酶消化)成单个细胞,在模拟体内的环境中,给以营养物质,使细胞不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的生长、分裂、接触抑制以及衰老、死亡等生命现象。

细胞培养也包括单个细胞的培养。

2. 器官培养(organ culture):器官培养是指器官的原基(芽胚基)、整个器官或器官的一部分,
在体外条件下保存(维持)或生长,并能分化和保持结构和/或功能。

3. 组织培养(tissue culture):组织培养是指组织在体外条件下的维持或生长。

此种方法可有
组织分化及保特组织的结构和/或功能的特点。

这里需要说明的是,当我们做组织培养时,不论用什么方法和条件,组织培养中的主要成分仍然是细胞;细胞在生长过程中总有移动(运动)和其他变化,这样就使得被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。

培养时间越长,发生变动的可能性越大。

结果常使单一类型的细胞易保存下来,最终也成了细胞培养。

***细胞培养,并不意味着细胞彼此之间是独立的。

细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样,仍然是相互依存的,呈现一定组织的特征。

所以组织培养和细胞培养并无严格区别,两者在一定程度上可看作是同义语。

3.2.3细胞体外培养可分为原代培养与传代培养
原代培养(primary culture):是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。

实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。

传代培养(subculture)：从原代培养的细胞继续转接培养的过程。

体外动物细胞在形态结构上均程度不同的与原来的细胞有所差异。

3.3 发展简史
1907（美）Harrison，用蛙淋巴液来培养蛙胚神经管,并观察到神经纤维是由细胞质进行阿米巴运动所形成。

动物细胞组织培养的奠基人）
1912（德）Carrel，用更换培养基和传代的方法解决了组织块长期存活的问题；设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。

1943Earle，培养C3H小鼠结缔组织并用致癌物20-甲基胆蒽处理，获得了能回种于小鼠体内并生长肉瘤的长期培养的细胞系，定名为L细胞系。

1548Sanfold，用预先处理的条件培养基成功地使L细胞系的一个单细胞在体外发展成“克隆”并繁殖成克隆株。

1951Gey，用人的宫颈癌组织建立在体外连续培养的人的肿瘤细胞系（HeLa细胞系）。

L 与HeLa细胞系是最早建成的细胞系。

1955Eagle研制成人工合成的培养基。

20AD70sSato等人发展了无血清培养。

20AD70s+，我国组织培养技术发展很快，最近我国科学家对干细胞的研究已走在世界前列,特别是治疗性克隆研究已达到世界先进水平。

3.4 动物细胞的体外培养生长特性
3.4.1在活体内的生长特性，动物细胞：增殖；分化。

分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。

例如：
肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能；
神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激；
红细胞呈圆盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；
上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。

活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：
（1）保持继续分裂能力的细胞，能不断分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞；
（2）永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞；
（3）静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂也不合成DNA，但在受到刺激后，重新进入细胞分裂期（人的肝脏细胞等）。

***第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。

3.4.2动物细胞的体外培养生长特性
离体培养的动物细胞可分为：贴附依赖型；非贴附依赖型；兼性贴附细胞。

1、贴附型细胞(贴壁细胞)：成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。

大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞。

（1）贴附:大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。

（2）结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。

（3）体外培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞
（4）细胞在体内、外的贴附方式差异
体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征。

体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。

贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料
（5）按细胞形态分类：成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞
○1成纤维细胞型细胞
名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的。

来源：中胚层间充质组织（成纤维细胞, 心肌,平滑肌,成骨细胞，血管内皮）。

形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2-3个长短不等的突起，中有卵圆形核。

生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。

○2上皮型细胞
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同。

来源：外胚层、内胚层细胞（皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤）。

形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。

生长特点：易相连成片，相靠-紧密相连-成薄层-铺石状生长，呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。

○3游走型细胞
特点：分散生长，细胞胞质常伸出伪足和突起，生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤
维样细胞型或上皮细胞型。

如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。

此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。

在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。

○4多形型细胞
特点：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。

如神经元和神经胶质细胞。

2、贴附型细胞（也叫悬浮型细胞）
特点：细胞体外生长不贴壁，可在培养液中悬浮生长，胞体始终为球形（血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系）。

这类细胞一般呈圆形，密度较大，培养效率高，可进行悬浮培养，易于大规模生产，便于过程的控制。

3、兼性贴壁细胞
动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。

3.4.3影响细胞形态学特征的主要因素
贴附生长型细胞的形态不稳定，条件改变，细胞形态可有变化。

（血清成分、培养基的酸碱度、气相环境、培养基成分及添加成分、温度等）。

Hela细胞原本是上皮型癌细胞，但若在过酸或过碱的条件下培养，可呈梭形，当酸碱度适中时又可恢复上皮型特征。

因此，细胞形态学仅是对培养物判断或识别的一种参考价值指标。

若想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异性的鉴定方法。

3.5 动物细胞培养的基本技术
3.5.1、培养细胞的生长特点
1、细胞在体外培养生长时其基本生物学规律与在体内时相同。

但由于生活环境条件的改变，有些方面如增殖的规律等，与体内不完全相同，而有其自身的规律。

体外培养细胞重要的生长特点有：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。

***************************************************************************** 接触抑制现象：除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。

当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成
片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。

（1）贴附和伸展：圆形--放射状--中心扁平--贴壁
影响因素：钙离子、温度、培养液流动速度、表皮生长因子等。

（2）接触抑制和密度抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。

******************************************************************************* 2、有限细胞系和永久细胞系
动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（primary culture）。

经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。

有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过30~50世代后细胞将逐渐死亡。

“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。

年龄越大继代次数越少。

人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。

大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。

有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。

**永久细胞系有如下特征：
细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。

永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前提。

3.5.2、培养细胞的生长过程
1、单个细胞生长过程：细胞周期
动物细胞分裂周期一般为12～48小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。

此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。

2、细胞系的生长过程
（1）原代培养期（初代培养）：从
体内取出组织接种培养到第一次传代，一般持续1~4周
特点：细胞移动活跃，可见细胞分裂但不旺盛。

与体内原组织在形态结构、功能上相似性大。

（2）传代期：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞在培养瓶中的生存空间和营养均有限。

当细胞增殖到一定密度后需要分离出一部分细胞，更新营养液。

这一过程叫传代。

**初代培养的细胞经过传代后就称细胞系。

特点：在全生命期中此期的持续时间最长，增殖最旺盛，维持二倍体核型。

3.5.3、培养细胞的遗传学特征
1、染色质与染色体
原代培养细胞多呈二倍体核型；当发生转化或成为肿瘤细胞时，大多失去二倍体核型，成为多倍体或异倍体。

在培养细胞中，会见到异常的染色体（双着丝点、环形染色体、长臂或短臂部分缺失）。

2、细胞性别
间期时女性有一个X染色体呈明显的异固缩状态，紧贴在核膜内面，呈半月形或三角形小体，称Barr小体。

男性Y染色体在间期时形成颗粒状Y小体，位于胞核近中央位处。

培养细胞的细胞核超微结构与体内细胞无大差别，仍保持性别特征，尤其原代培养细胞易于显示，用特殊染色法均可观察到Barr小体和Y小体。

3.5.4、体内外细胞的差异及培养细胞的分化
1、体内外细胞的差异（基因未变，基因表达改变）
当将细胞置于体外培养环境时，由于失去了神经、激素等体液的调节和细胞间相互影响，生长在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，多次传代增殖后，培养细胞将失去原有组织结构和细胞形态，分化逐渐减弱或不显，出现类似返祖现象。

2、培养细胞的分化
体外培养细胞的分化能力并非完全丧失，只是因为所处环境的改变，细胞分化的表现与在原体内不同。

3.5.5、动物细胞培养的基本条件
在体外培养细胞必须要能够维持和模拟细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程。

为此必须提供必要的营养、严格的无菌条件、适宜的pH、渗透压、培养器皿、温度和CO2等条件。

显著污染的标志是培养基pH迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现飘浮的集落。

1、动物细胞培养的环境要求
（1）无污染环境
（2）温度：不同的细胞，其最适生长温度不尽相同。

昆虫细胞培养温度一般是25～28℃
哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。

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总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。

如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。

液氮冻存。

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（3）pH
动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。

培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。

（4）气体环境及溶氧
一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。

除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。

开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。

（5）渗透压
动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：
一是培养基的渗透压维持；
二细胞体内的渗透压维持。

大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。

动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。

2、动物细胞培养的营养要求
（1）天然培养基
采用动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。

血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。

它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。

使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。

血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。

与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。

血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。

蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。

（2）合成培养基
目前用于动物细胞培养的合成培养基种类很多，一般均包含氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分（激素、生长因子）。

尽管各种合成培养基给细胞培养带来极大方便，但许多实验表明，单纯使用合成培养基细胞的贴壁、增殖效果常常不理想。

因此，在使用时通常仍然需要加入一定量的动物血清，常用的动物血清有小牛血清、鸡血清等。

常用的人工培养基MEM，DMEM，RPMI-1640
（3）无血清培养基
动物血清成分复杂，对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。

另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。

无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。

（4）细胞培养液
1、平衡盐溶液（BSS）
2、消化液：胰蛋白酶液、Na2- EDTA液、胶原蛋白酶液
3、pH调整液：NaHCO3溶液、10%醋酸溶液、HEPEs液
4、抗菌素液：青霉素、链霉素（双抗）液、卡那霉素液、制霉菌素液
5、肝素抗凝剂
6、200 mmol/L 谷氨酰胺
3、培养工具
根据不同性质的培养可采用不同的培养器皿:
固体单层培养——塑料或玻璃瓶壁
半固体培养——胶原或琼脂等凝胶培养
悬浮培养——培养基直接培养。

现在通常使用优质中性玻璃制成的长方形玻璃培养瓶,规格有100mL、25mL和15mL等。

有时还用扁圆形的卡氏瓶。

它们的优点是可以清洗、消毒、反复使用。

细胞培养所用的器皿必须干净,器械的清洗是十分重要的,它直接影响到细胞培养的成败。

3.5.6、动物细胞培养的基本技术
1、传统培养方法
（1）悬滴培养法——最简单、最原始的培养法
悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能持续长时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，不便于观察。

（2）旋转管培养法(rotate tube culture)
①组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长；
②培养管缓慢转动，使整个管内壁全部长满细胞，提高了细胞产量，适于较大量的组织培
养和各种长期传代细胞①组织块或细胞可交替的培养。

缺点：不易在显微镜下观察。

（3）灌注小室培养法：为大规模培养系统提供了参考原理。

（4）卡氏瓶培养法
①将组织块剪碎，BSS漂洗。

②转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要的组织如脂肪、坏死组织等。

将组织
块切成1mm3小块。

③用预先润湿的滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，吸去上清。

以新鲜BSS
漂洗。

重复2~3次。

④转移到培养瓶（每个25ml的培养瓶可放置20~30块组织小块），吸去液体。

加入1ml
生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。

盖好瓶盖，36.5℃培养18~24h。

⑤待组织块粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培养液；然后每周更新培养液一次。

培养3~5
周，细胞不断增长，肉眼或低倍镜下观察可见围绕组织周围生长犹如日晕，称“生长晕”。

⑥取出中央组织块，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶。

重复④~⑥操作。

⑦在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。

待生长晕细胞扩展至约50%培养瓶底表面时，
进行细胞培养。

2、原代培养
（1）实验准备：①取材、分离细胞；②原代培养；③维护培养
着装：操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，然后用1‰新洁尔灭浸泡消毒5分钟原代培养的一般流程
操作：①将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

②将小白鼠置超净台上，打开腹腔。

③用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪。

④剪碎组织。

（2）原代培养方法：
组织块培养法
消化法：单细胞法；半消化法
①组织块法：接种组织块；移入培养箱中（贴有组织块的一面向上）；静置2~3小时，然
后翻转培养瓶继续静置培养；
②消化法：取材；漂洗；剪碎；酶解（单细胞）；离心洗涤；加液；计数接种。

③半消化法：取材；漂洗；剪碎；酶解（部分酶解）；沉降洗涤；加液；接种。

（3）例：小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
①获取小鼠胚胎
将8周龄昆白♀、12周龄的昆白♂按1:1合笼。

次日晨10:00前观察♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天；
断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。

75％酒精消毒，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉剥皮。

用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。

用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。

将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。

在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。

将子宫移入另一盛有PBS 的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。

将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。

将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。

②分散细胞
将干净的鼠胚躯干移至干净的培养皿内（一般6个鼠胚躯干装1皿，视大小而定），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块。

用移液器每皿加入3ml的PBS，混匀，静置30sec，用移液器吸去上清液；向装有鼠胚碎块的培养皿内加入1ml0.25%胰蛋白酶\0.02%EDTA混合消化液，用1ml移液器轻轻吹吸30秒，可见组织块变得较为粘稠，缓慢摇动培养皿2-5min后利用倒置显微镜观察组织块变透明，并有单细胞脱离时即可进行组织块半消化的原代培养；留小部分鼠胚碎块于培养皿中用于组织块半消化原代培养，其余移至一尖底离心管中，置37℃水浴摇动消化15-20min，用于细胞计数及细胞冻存实验；
培养皿中立即加入1ml含50%新生牛血清的PBS，吹打混匀，以终止酶的作用；离心管消化结束后，静置5min，用移液器小心将上清液转移到另一离心管中，并加入1ml 含50%新生牛血清的PBS中，吹打混匀，以终止酶的作用，1000rpm离心5min，弃上清，沉淀即为分散的鼠胚成纤维细胞
③接种培养
用移液器吸去培养皿中的多余液体加入适量含20%新生牛血清的DMEM培养液，将
组织块转移至新的培养皿（瓶）中，并均匀分布在培养皿（瓶）的底部，做好标记（日期、名称、编号），放入37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。

细胞沉淀用适量含20%新生牛血清的DMEM培养液重新悬浮；利用血球计数板计数，调节细胞密度为105个/ml，计算细胞的存活率；剩余细胞悬液用于细胞冻存实验（具体见“细胞的冷冻保存”部分）
第2-3天可以观察，组织块半消化原代培养可见组织碎块附着于培养瓶（皿）底部，周围细胞呈放射状生长，此时可见有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。

3、传代培养
将原代培养物分割后重新接种到两个或多个培养瓶内进行培养，这一操作称为传代培养,传代比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异.
细胞传代培养的意义
传代时机的把握
传代培养的代数限制；少数细胞可出现永生化
（1）贴附型：
①观察培养细胞（培养基、细胞）
②吸去旧液
③PBS洗涤1~2次
④加入消化液解离细胞约3min
⑤在倒置显微镜下观察（细胞圆粒状）⑥培养瓶中国加入适量含血清培养液
⑦吹打悬浮细胞
⑧调整细胞密度
⑨分装接种，于CO2培养箱中培养
（2）悬浮型
①直立瓶②去旧液③加新液④分瓶接种⑤加新液⑥直立瓶
4、动物细胞的大规模培养
3.5.7、细胞系与细胞株（cell line and clone）
（1）细胞系的建立。