_睡美人_转座子的研究进展_谢飞

HEREDITAS (Beijing)

2007年7月, 29(7): 785―792 ISSN 0253-9772

综 述

收稿日期: 2006−11−06;修回日期: 2007−02−04

作者简介: 谢飞（1981−）, 男, 在读硕士生, 研究方向: 动物遗传资源评价、保护与利用。E-mail: asdxiefei@

通讯作者: 宋成义（1974−）, 男, 博士, 研究方向: 动物遗传育种, 动物生物反应器研究。E-mail: chengyilab@

DOI: 10.1360/yc-007-0785

“睡美人”转座子的研究进展

谢飞1, 高波, 宋成义, 陈国宏

扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225009

摘要: “睡美人( Sleeping Beauty, SB) ”转座系统是Tc1/mariner 转座子超家族中的一员,已经失活了一千多万年。1997年，Ivics 等根据积累的系统发生数据,利用生物信息学的方法, 对其进行分子重建, 终于唤醒了其转座活性。近年来对“睡美人”转座系统的转座效率和转座机理进行的研究，已证明SB 转座子在基因筛选，转基因及基因治疗等领域具有广阔的应用前景。文章重点论述了SB 转座子在结构及其优化、转座机制和应用等方面的进展，同时对其研究中出现的各种问题进行了总结并提出了一些解决方案。 关键词: “睡美人”转座子; 脊椎动物; 转座机制

Advances in studies of Sleeping Beauty transposon

XIE Fei, GAO Bo, SONG Cheng-Yi, CHEN Guo-Hong

College of Animal Science and Technology , Yangzhou University , Yangzhou 225009, China

Abstract : The Sleeping Beauty (SB) transposon is a Tc1/mariner family transposon that has been transpositionally inactive

for over 10 million years. The SB transposon system was awakened from inactiveTc1-like transposable elements by using molecular phylogenetic data in 1997. Recent studies on its transposition efficiency and mechanism have shown its broad applications in vertebrate animals for gene-screening, gene transfer, and human gene therapy. In this review, we summarize our current knowledge of Sleeping Beauty, such as structure, transposition mechanism and potential applications, and bring forward some means aiming at the limitations of transposon technology.

Keywords: Sleeping Beauty transposon; vertebrates; transposition mechanism

转座子又称可移动基因, 跳跃基因, 是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的DNA 序列。早在20世纪50年代, 首先由McClintock 在玉米中发现[1], 以后又陆续在细菌、

真菌及动植物中都有发现, 如细菌中的Tn5, 酵母中的Ty 以及来源于鳞翅目昆虫的piggyBac 转座子等。

转座子从一个位置转座到另一个位置的转入和切出过程, 改变了原有基因的结构和排序, 从而产生了突变。目前生物体中所发现的10%的突变是由于它抑制其他基因的表达而形成的。利用转座子在受体基因组的可整合性,构建了果蝇P 因子、hobo 因

子、piggyBac 转座子、mariner 因子等多种转座表达载体, 已成功地转化了多种外源基因[2,3]。最近Ding

等[4]在研究中发现, 一般用于昆虫的piggyBac 转座系统还具有在小鼠的生殖细胞中转座的能力, 表明一些转座子可能并不具有严格的物种特异性。

脊椎动物基因组中也存在着大量的转座子, 主要分为两类: 一类是具有类似反转录病毒结构的Ι型转座子, 采用“复制粘贴”机制, 首先将DNA 转录为RNA ，在反转录酶的作用下合成DNA, 反转录的DNA 插入染色体的其他部位, 结果在染色体上的位置发生了移动。另一类是Ⅱ型转座子，主要采用

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“剪切粘贴”的转座机制, 将DNA 从染色体上切下来后直接插入到别的部位, 由两端较短的反向重复序列(inverted terminal repeat , ITR) 和编码转座酶的基因组成, 但是此类转座子的转座酶大都在漫长的进化中失活。作为基因转移和表达系统的转座子只是在细菌、真菌、植物和无脊椎动物中应用较多, 长期以来在脊椎动物中仍然是空白。直到1997年Ivics 等[5]基于积累的系统发生数据, 利用生物信息学的方法, 收集8个不同鱼类品种的12个失活的鲑鱼科亚家族, 对Tc1 类转座酶的基因序列多重序列比对(multiple sequence alignment) , 以其中5个同源性较高的保守结构域进行了重建。

重建的第一步是通过将两个不同来源的片段互补拼接在一起, 从而恢复一个完整的开放阅读框 (图1:a, SB1~SB3), 在此过程中还要消除中间未成熟的终止子和移码突变, 由于SB3的序列还有24个位置上与保守区域的一致序列不符, 因此它还不具

备转座能力。然后, 通过PCR 引入定点突变的方法, 构建了一系列序列(图1: a, SB4~SB10), 最终完成的SB10基因编码长340个氨基酸的蛋白质。在T 元件的选择上, Ivics 等选择了保守性最好的一个品种Tanichthys albonubes 的IR/DR 作为“睡美人”转座酶特异识别的DNA 序列, 这样带有T 元件的转座子和介导其转座的转座酶一同构成了完整的“睡美人”转座系统(图2, 图1: b) 。至此, “睡美人”终于苏醒了[6]。

与其他转座系统的效率相比, “睡美人”在脊椎动物中的转座效率最高[7], 它不仅能在体外培养的鱼、小鼠和人[8]等大多数脊椎动物的细胞中发生转座, 还可以在动物体内介导外源基因的稳定整合和长期表达[1,6], 但体内的转染效率要比体外高[9]。近

年来, 通过对转座子的反向重复序列和转座酶的优化, 睡美人的转座效率成倍增加, 而且大片段的转座效率也有所提高[10~13]。整合的“睡美人”可以通过生殖细胞稳定地传递给后代, 在后代中表达外源基

图1 “睡美人”转座酶的重建

a: “睡美人”转座酶基因的重建过程。与一致序列不同的氨基酸残基用黑色字母表示, 顶端黑色箭头表示其位置; 经突变成为一致序列的氨基酸残基用白色斜体字母表示; “ * ”表示未成熟的终止密码子; “ # ”表示移码突变; 右侧箭头旁的说明文字显示在重建的特定阶段SB 转座酶的结构或功能的恢复情况。b: “睡美人”转座酶基因各结构域的示意图。

Fig. 1 Reconstruction of SB transposase

a:Reconstruction progress of SB transposase. Amino acid residues are typed black when different from the consensus and their positions within the transposase polypeptide are indicated with arrows; Amino acids changed to the consensus are typed white italic; Translational termination codons appear as asterisks; Frame shift mutations are shown as number signs; In the right margin, the various functional tests that were done at certain stages of the reconstruction procedure are indicated. b: Domains of SB transposase .