piggyBac转座子应用研究进展
甜菜夜蛾与棉铃虫内源性piggyBac转座子的研究的开题报告
甜菜夜蛾与棉铃虫内源性piggyBac转座子的研究的开题报告一、选题背景与意义甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）为半夜蛾科昆虫，是全球重要的农业害虫之一。
其幼虫可对多种农作物进行大量损害，如蔬菜、水果、玉米、棉花等，给农业生产带来极大的影响。
棉铃虫（Helicoverpa armigera）也是重要的农业害虫之一，对棉花、玉米、蔬菜等作物也造成了很大损失。
目前，甜菜夜蛾和棉铃虫主要通过化学农药来控制，然而由于化学农药的副作用，其使用已经引起了人们的高度关注。
为了避免这种危害，越来越多的研究者试图研究使用基因工程技术来控制害虫，而内源性piggyBac转座子正是一种被广泛用于转基因昆虫研究中的工具。
二、研究目的本研究旨在通过将内源性piggyBac转座子导入甜菜夜蛾和棉铃虫中，观察其对昆虫生长发育以及繁殖力的影响，为探索基于转基因技术的害虫防治方法提供一定的理论和实践依据。
三、研究内容和方法（一）研究内容1. 制备内源性piggyBac转座子。
2. 构建内源性piggyBac转座子质粒载体。
3. 将内源性piggyBac转座子导入甜菜夜蛾和棉铃虫中。
4. 观察转基因昆虫的生长发育以及繁殖力。
5. 检测转基因昆虫是否会对环境造成影响。
（二）研究方法1. 内源性piggyBac转座子的制备：通过PCR扩增内源性piggyBac转座子序列，并进行酶切和连接操作来构建内源性piggyBac转座子。
2. 构建内源性piggyBac转座子质粒载体：将内源性piggyBac转座子插入适当的质粒载体中来构建内源性piggyBac转座子质粒载体。
3. 将内源性piggyBac转座子导入甜菜夜蛾和棉铃虫中：通过生物转化法或注射法将内源性piggyBac转座子质粒载体导入甜菜夜蛾和棉铃虫中。
4. 观察转基因昆虫的生长发育以及繁殖力：观察转基因昆虫与野生型昆虫的生长发育和生殖力，并进行对比分析。
5. 检测转基因昆虫是否会对环境造成影响：通过对转基因昆虫在田间释放后的生态环境进行监测、评估，判断转基因昆虫是否会对环境造成影响。
piggybac 转座子作用机理
piggybac 转座子作用机理一、啥是piggybac转座子呀。
这个piggybac转座子呢，它其实是一种可以在基因组中移动的DNA序列哟。
就好像是基因组这个大社区里的一个“小搬家侠”，能够从一个地方搬到另一个地方呢。
它最早是在昆虫里被发现的，后来人们发现它在好多生物里头都能发挥作用，简直就是生物界的一个“万能小能手”呀。
二、piggybac转座子的结构特点。
它的结构啊，还挺特别的呢。
一般来说，它有两端的反向重复序列，这就像是它的“把手”一样，抓着中间的那些基因信息。
中间呢，就包含了一些和它转座相关的基因，这些基因就像是它的“行动指南”，告诉它什么时候该搬家，怎么搬家。
而且啊，它的大小也不是固定不变的，不同的piggybac转座子可能长度会有点不一样哦。
三、piggybac转座子的转座过程。
这转座过程啊，可有意思啦。
它就像是坐“出租车”一样，先找到合适的“站点”，也就是目标位点。
然后呢，在一些酶的帮助下，它会把自己从原来的位置上“剪”下来。
这时候啊，它就像是一个小包裹一样，准备被运送到新的地方去啦。
接着，它会准确地插入到目标位点上，就像是找到了新的家一样。
这个过程啊，需要好多蛋白质和酶的参与，它们就像是一群勤劳的小助手，帮着piggybac转座子完成这次“搬家之旅”。
四、piggybac转座子的作用。
它的作用那可多啦。
一方面呢，它可以用来进行基因编辑。
科学家们就像是聪明的“设计师”，利用piggybac转座子把一些有用的基因插入到生物的基因组里，或者把一些不好的基因给替换掉，这样就能让生物变得更健康、更优秀啦。
比如说，在农业上，就可以用它来培育出更抗病虫害的农作物呢。
另一方面啊，它还能帮助我们研究基因的功能。
通过让它在基因组里“跳来跳去”，我们就能观察到不同基因的变化，从而了解它们到底是干什么的，就像是给基因们做了一场“大调查”呀。
五、piggybac转座子的应用前景。
这个piggybac转座子的应用前景可是一片光明哟。
一种由piggyBac转座子介导高效构建稳定细胞株的策略
ISSN 1002-4956 CN11-2034/T实验技术与管理Experimental Technology and Management第38卷第3期202丨年3月Vol.38 No.3 Mar. 2021DOI: 10.16791/ki.sjg.2021.03.010一种由piggyBac转座子介导高效构建稳定细胞株的策略盛哲津、王亮2，周斌\李利妹4(1.同济大学生命科学与技术学院，上海200092; 2.上海市浦东新区中医医院，上海200120; 3.同济大学附属东方医院血管外科，上海200120; 4.同济大学附属东方医院医学转化平台，上海200120)摘要：构建稳定细胞株的关键是如何提高外源目的基因插人基因组的效率。
piggyBac转座子（简称PB )通过“切离-粘贴”的机制实现在基因组上的转座，其本质是在基因组的不同位点间进行插入。
利用P B转座子高效插人基因组的特性，并通过改造该转座系统，即分别在P B转座酶的3'端和5'端加入核定位信号肽，然后在人源胚胎肾293细胞系中评价改造后的P B转座子介导获得稳定细胞株的能力。
结果表明，野生型PBase组的克隆形成率是对照组的6.7倍,3'NLSPBase组比野生型PBase组再提高1.3倍。
利用人宫颈癌HeLa 细胞进一步验证上述结果。
可见，经改造后的P B转座子能够提高外源目的基因插入基因组的效率，实现高效构建稳定细胞株。
关键词：piggyBac转座子；稳定细胞株；基因组整合中图分类号：Q2 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2021)03-0045-06Strategy of efficient construction of stable cell linesmediated by piggyBac transposonSHENG Zhejin',WANG Liang2,ZHOU Bin3,LI Limei4(1. School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China; 2. Shanghai Pudong New Area Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200120, China; 3. Department of Vascular Surgery, East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200120, China; 4. Research Center for Translational Medicine, East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200120, China)Abstract: Insertion of foreign target genes into the genome is crucial to the construction of stable cell lines. piggyBac transposon (PB) can translocate between different loci in the genome via the “Cut-and-paste” mechanism. The nature of this process is the insertion of foreign target genes into different sites in the genome. A nuclear localization signal peptide is added to the 3' or 5' ends of PB transposase respectively to modify the PB transposon system. The efficiency of the construction of stable cell lines mediated by PB transposon is evaluated in the human embryonic kidney 293 cell line. The results demonstrate that the clone formation rate of wild-type PBase group is 6.7 times that of the control group, and that of B'NLSPBase group is 1.3 times higher than that of wild-type PBase group. The above results are verified in HeLa cells. The modified PB transposon can improve the efficiency of exogenous target gene insertion into the genome, which will help to achieve high efficient construction of stable cell lines.Key words: piggyBac transposon; stable cell lines; genome integration细胞转染技术是现代生命科学领域的一项基本技 术，广泛应用于生命科学的基础研究，推动了诊断、治疗方面的发展1M]。
转座子在基因工程中应用的研究进展
全基因组序列分析
斑马鱼 Danio rerio
全基因组序列分析
血红丛赤壳菌 Nectria haematococca
全基因组序列分析
水稻 Oryza sativa
全基因组序列分析
大豆疫霉菌 Phytophthora sojae
全基因组序列分析
家鼠 Rattus spp
全基因组序列分析
海胆 Strongylocentrotus purpuratus
1
反转录转座子不同于转座子，是以DNA-RNA-DNA的途径来实现转座，在整合酶的作用下，将新 生成的以DNA状态存在的反转录转座子整合到宿主基因组中。这样，反转录转座子在宿主基因组中的 拷贝数得到不断积累，从而使基因组增大。由于反转录转座子带有增强子、启动子等调控元件，所以 会影响宿主基因的表达。在生物进化过程中，反转录转座子起着不可忽视的作用。根据是否具有编码 反转录酶的能力，反转录转座子可分为两个家族: 自主性反转录转座子和非自主性反转录转座子；按 照序列结构中有无长末端重复序列(LTR) 又可分为有LTR反转录转座子和无LTR反转录转座子。自主 性反转录转座子包括内源性反转录病毒(ERV) 、LTR反转录转座子及长散在元件(LINEs)；非自主性反 转录转座子包括短散在元件(SINEs) 及修饰性反转录假基因(刘冬，2008)。
赤拟谷盗 Tribolium castaneum
全基因组序列分析
银锭夜蛾 Macdunnoughia crassisigna
同源克隆
表 1 来源：王建军，等，2009。
与其他转座子相比，piggyBac 转座子在昆虫纲中分布较少，但其却能在亲缘关系较远的物种中发
挥作用。目前，利用 piggyBac 转座子已经成功获得了多种转基因昆虫(表 2)。
piggyBac转座子在金鱼及泥鳅转基因中的应用
piggyBac转座子在金鱼及泥鳅转基因中的应用胡莹莹;郭学双;周阳;曹广力;贡成良;薛仁宇【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2012(036)010【摘要】为了探讨piggyBac转座子在鲤科鱼类及鳅科鱼类转基因中的适用性,实验通过将PAβ启动子控制的DsRed表达元件插入pigA3GFP中,构建转基因载体pigA3 GFP-AβDsRed.用该载体对草鱼肾脏(CIK)细胞转染,结果显示,通过piggyBac转座子可将外源基因导入到CIK细胞的基因组中,来源于家蚕的A3启动子和来源于巨细胞病毒的CMV启动子在CIK细胞均具有活性.将转基因载体pigA3GFP、pigA3GFP-AβDsRed分别与辅助质粒helper-pigA3混合后以精子介导法导入金鱼和泥鳅的受精卵后,经荧光观察、PCR鉴定、Dot blotting鉴定,证实获得了转基因金鱼和转基因泥鳅.研究表明,PB转座子在鲤科鱼类及鳅科的一些鱼中具有转座活性.%Development of transgenic fish techniques and application will promote traits improvement of fish and benefit exploration of its gene function. To investigate the applicability of the transposon piggyBac in Cyprinidae and Cobitidae fish, the expression element of DsRed under the control of PAβ promoter was inserted into the plasmid pigA3GFP to generate transgenic vector pigA3GFP-AβDsRed. The results of the CIK cell transfected with pigA3GFP-AβDsRed showed that the transposon piggyBac could transfer exogenous genes into CIK genome, and both of the promoter A3 from silkworm and the promoter CMV from CMV have the bioactivity. Moreover, the pigA3GFP-AβDsRed andpigA3GFP were mixed with helper plasmid helper-pigA3 respectively, and then were introduced into the eggs of goldfish and loach by sperm-mediated transfer. The results of fluorescence observation, PCR and Dot blotting verified that both transgenic goldfish and loach were obtained. Therefore,PB transposon was considered to be active in some fishes of Cyprinidae and Cobitidae.【总页数】9页(P1473-1481)【作者】胡莹莹;郭学双;周阳;曹广力;贡成良;薛仁宇【作者单位】苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123【正文语种】中文【中图分类】Q782;S917.4【相关文献】1.piggyBac转座子及其转基因昆虫的应用 [J], 唐丽莉;陈斌;何正波;李廷景2.PiggyBac转座子介导的诱导细胞永生化转基因载体的构建及其整合效率的检测[J], 张婷婷;辛颖;张志强;任充华;杨涵江;王令;张智英3.piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展 [J], 钟伯雄;危浩;庄兰芳4.绵羊高效转基因通用型piggyBac转座子载体构建及功能验证 [J], 胡广东;郝科兴;黄涛;曾维斌;谷新利;王静5.A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究 [J], 杨惠娟;庄兰芳;范伟;兰天云;丁农;陆长德;钟伯雄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
昆虫转基因载体——piggyBac转座子
总是 !"##$%&’ 转座 子的 切 出模 式 是唯 一 的， 在切出 的地方留 下准确的切 出痕迹， 而其它两 类 转座子通常 在切 出沟 里留 下完 整 的核 苷酸 或 末
［/］ 端残基， 导致不准确的切出痕迹 。
［ !］ B、 :5L 和 $# 因子 。/0112345 转 座子最 初是在 杆
子总是在 ::$$ 目标 位点 处插 入， 因而 被归 纳为
［,］ ::$$— — —特殊的可转移因子家族 。
)
!"##$%&’ 转座子的切出和转座
对于一个转座子来 说， 能 否利用 其作为 一个
状病毒 （345MLIN0EMG ） 侵 染 !"#$%&’()*#+ ,# 昆虫 :%@ -"A 细 胞株 系 时， 从 -+((."#+ /.((&,.((+ （ OFP%B%） 或 0)1&2"+’%+ $+(#3&",#$+ （ $5P%B%） 核多 角 体 病 毒 内首次分 离 得到 的
［!］ 出。在黑腹果蝇、 黄色伤 寒蚊、 和 !"#$%&’()*#+ ,#
家蚕卵细胞内等的转座测试也表明 /0112345 转座
增刊
颜海燕等： 昆虫转基因载体— — —!"##$%&’ 转座子
［4］ 用 。
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子能够转座， 而且切出和转座的频率都较高。 !"# $%&&’()* 转座子的切出和转座特征 !"##$%&’ 转座子在切 出和插 入时都 需要其 本
PiggyBac转座子在肝脏中的活性研究
PiggyBac转座子在肝脏中的活性研究刘华华;缪辉;葛梦芸;吴传芳【摘要】本实验运用高压尾静脉注射的方法将PB转座系统导入小鼠肝脏,研究其在肝脏中的转座活性,系统中PB转座子携带表达红色荧光蛋白的基因以指示转座的发生.注射10个月后取出小鼠肝脏,体视荧光显微镜观察肝脏是否有红色荧光,并通过基因组PCR、splinkerettePCR分析PB转座子在肝脏中的插入情况.实验结果表明,PB转座子在肝脏内发生高效转座,检测的68个PB插入位点中有34个位于基因序列,使得PB系统可以作为有效的基因诱变工具来研究基因功能.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(053)005【总页数】5页(P1130-1134)【关键词】PiggyBac(PB)转座子;高压尾静脉注射;Splinkerette PCR;插入突变【作者】刘华华;缪辉;葛梦芸;吴传芳【作者单位】四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064;四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064;四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064;四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q789PB(piggyBac)转座子来源于粉纹夜蛾，可以在哺乳动物细胞中高效转座[1-6]，诱导基因的插入突变来研究基因的功能．作为基因诱变剂，PB有独特的优势[1-6]：1)插入位点广泛分布于基因组中，且倾向于插入基因编码的活跃区；2)PB转座发生后精确切离，原插入位点不会发生突变；3)PBase可以单独克隆，反式调节PB的转座；4)PBase对PB的转座没有过量抑制现象；4)PB可以携带遗传标记基因，方便鉴定PB的插入且不影响其转座活性；5)与逆转录病毒相比操作更加安全、简便．我们使用本实验构建好的PB转座系统，包括供体质粒Donor(PB)和辅助质粒Helper(PBase)，其中PB携带红色荧光蛋白(RFP)标记转座的发生，PBase可以在真核细胞中自主表达．目前，PB多用于转基因的研究[7-11]，本实验主要通过研究PB转座子在体内肝脏细胞中的转座活性，分析其在体内作为插入诱变工具的可行性．将外源基因特异性导入肝脏有多种途径，但都有一定的局限性，如逆转录病毒载体导入法需要将肝脏部分切除或通过肝损伤来刺激肝细胞分裂．研究表明，通过物理方法将裸质粒DNA直接导入靶器官同样可以获得目的基因的高效表达[12]．高压尾静脉注射法，即将大体积的注射液快速注入尾静脉，由于肝脏的组织特点，该方法可以直接将质粒注入到肝脏，实现外源基因在肝脏细胞中的表达；此法操作简便，且不会对肝脏造成永久性伤害[13-16]．我们运用这一方法将PB转座系统导入肝脏，通过观察肝脏的红色荧光、基因组PCR和splinkerette PCR技术[17]来确定PB的转座情况以及插入位点．实验结果表明，PB转座子在体内肝脏中有较高的转座活性．该结果为PB共转染系统用于小鼠体内研究又迈了一步，为肝脏基因功能的研究提供了一条新的方法思路．2.1 材料2.1.1 菌株、质粒和实验动物大肠杆菌菌株E. coli. DH5α由本实验室保存，PB转座系统(Donor和Helper)由本实验室提供[18]，Balb/c小鼠由四川大学华西实验动物中心提供．2.1.2 主要试剂Taq酶、限制性内切酶及T4 DNA ligase 均购自Fermentas公司，DNA marker 购自天根生物科技公司，SsoFastTM EvaGreen® 试剂盒购自BIO-RAD公司，pMD-19T载体购自Takara公司，质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒及基因组提取试剂盒均购自Foregene公司，质粒大提试剂盒购自Invitrogen 公司，寡核苷酸引物合成、接头(adaptor)片段的合成及测序均由北京六合华大基因科技有限公司完成．2.2 方法2.2.1 高压注射PB转座系统由两种质粒构成，分别是Donor和Helper．其中Donor提供PB必须的转座元件3′ITR(Inverted Terminal Repeat，末端反向重复序列) 和5′ITR(图2A显示ITR的相对位置)，红色荧光蛋白基因位于两段序列之间，指示PB的转座；Helper携带PB转座必须的转座酶PBase．将150只六周龄Balb/c小鼠随机分A、B、C 3个组，三种不同的注射液(表2)分别注射小鼠尾静脉．注射液的体积按小鼠重量的10%计算(如小鼠重量为20g，则注射液体积为2ml)，于5s-7s内将注射液经尾静脉快速推入体内．质粒的注射量详见表1．A、B两组作为阴性对照．the corresponding injection2.2.2 基因组PCR 使用OLYMPUS SZX2-ILLB体视显微镜观察小鼠肝脏是否发出红色荧光，对于实验其间濒临死亡或死亡的小鼠要及时取出并观察是否发出荧光，并进行下文提到的所有检测。
一种高活性piggyBac转座酶及其应用[发明专利]
![一种高活性piggyBac转座酶及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a67a057432687e21af45b307e87101f69e31fb38.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910105753.1(22)申请日 2019.02.01(71)申请人 潘雨堃地址 201100 上海市闵行区都市路2501弄148号(72)发明人 潘雨堃 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限公司 31253代理人 冯子玲(51)Int.Cl.C12N 9/12(2006.01)C12N 15/89(2006.01)A01K 67/027(2006.01)A61K 48/00(2006.01)A61K 38/45(2006.01)(54)发明名称一种高活性piggyBac转座酶及其应用(57)摘要本发明的目的在于提供一种高活性piggyBac转座酶及其应用。
一种piggyBac转座酶，其特征在于：氨基酸位点165位的甘氨酸改变为半胱氨酸，或氨基酸位点282位的蛋氨酸改变为苏氨酸，或这两个位点同时发生上述改变。
本发明的高活性piggyBac转座酶，提高了piggyBac转座子系统的转座效率。
权利要求书1页 说明书19页 附图3页CN 111518785 A 2020.08.11C N 111518785A1.一种piggyBac转座酶，其特征在于：氨基酸位点165位的甘氨酸改变为半胱氨酸，或氨基酸位点282位的蛋氨酸改变为苏氨酸，或这两个位点同时发生上述改变。
2.如权利要求1所述的piggyBac转座酶，在制备介导缺陷piggyBac转座子转座插入HEK293细胞基因组的试剂中的应用。
3.如权利要求1所述的piggyBac转座酶在制备基因整合试剂中的应用。
4.如权利要求1所述的piggyBac转座酶，在制备无痕基因修复的试剂中的应用，其特征在于：piggyBac转座酶为PBase(G165C/M282T)。
5.如权利要求1所述的piggyBac转座酶，在建立转基因非人动物中的应用，其特征在于：包括将编码新型高活性piggyBac转座酶PBase(G165C/M282T)和携带Katshka远红外荧光蛋白编码序列的piggyBac转座子同时显微注射入小鼠受精卵内的步骤。
piggyBac转座子及其在转基因昆虫中的应用
科技前沿piggyBac 转座子及其在转基因昆虫中的应用3王建军133 王常春1 韩召军2(1.扬州大学园艺与植物保护学院 江苏扬州 225009;2.南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室 江苏南京 210095)Advances on piggyBac transposon and its applications in insect transgenesis .W ANGJian 2Jun133,W ANG Chang 2Chun 1,H AN Zhao 2Jun 2(1.College o f Horticulture and Plant Protection ,Yangzhou Univer sity ,Y angzhou 225009,China ;2.K ey Laboratory o f Monitoring and Management o f Plant Diseases and Pests ,Ministry o f Agriculture ,Nanjing Agricultural Univer sity ,Nanjing 210095,China )Abstract The piggyBac element is a TT AA 2insertion site specific DNA transpos on and was originally discovered in Trichoplusia ni .The piggyBac element is capable of precise excision and shows high frequency of trans formation ininsect genome ,and its activity is less restricted by host factors.These characteristics make piggyBac the m ost widely used gene vector in insect transgenesis.Recent studies revealed that piggyBac 2like element is distributed in a wide variety of insect and other organisms.In this review ,we introduced the structure and transposition characteristics of piggyBac and its application in insect transgenesis ,and the distribution of piggyBac 2like elements was als o described.K ey w ords piggyBac ,transpos on ,insect transgenesis ,insect genome ,gene vector摘 要 piggyBac 是一种从粉纹夜蛾Trichoplusia ni .中分离到的、具有TT AA 插入位点特异性的DNA 转座子。
piggyBac 转座系统的功能改进及在哺乳动物中的应用
第 10 期
钱秋杰等: piggyBac 转座系统的功能改进及在哺乳动物中的应用
967
(Binding domain)、催化结构域(Catalytic domain)和 核定位信号(Nuclear localization signals)，可能还存 在转座酶之间作用的功能域。已有研究表明，PB 转 座酶的核定位信号存在于转座酶 C 端第 551~571 氨 基酸之间[51]。DDE 重组酶具有结合镁离子的催化核 心域 DDE 结构域，而结构预测和突变筛选都显示 PB 转座酶的第 268、346、447 个天冬氨酸(D)也具 有类似 DDE 结构域的功能[47,52]，该结构域附近的其 他保守氨基酸与转座酶的切割和插入功能有关，将 第 372 位精氨酸残基与第 375 位赖氨酸残基突变成 丙氨酸后，获得的 PB 转座酶只有剪切功能而丧失了 插入功能[53]。通过氨基酸序列比较发现，PB 转座酶 存在几个氨基酸保守性比较丰富的区域[52]，这些保 守区域很可能是转座酶的功能区域。用染色质免疫 沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)证实 PB 转座酶在无转座臂的情况下，也可以结合到 TTAA 序列[35]。以上研究结果表明，PB 转座酶具有 多个功能结构域，深入地理解转座酶的这些结构域 在转座功能上的作用，将有利于对 PB 转座酶进行改 造，提高转座酶的转座活性，改善靶向转座的能力。
关键词： piggyBac；转基因；靶向插入；转座
n of piggyBac transposon system in mammals
Qiujie Qian, Jiaqian Che, Lupeng Ye, Boxiong Zhong
转座子在基因工程中应用的研究进展
piggyBac 转座子将会被广泛地用作昆虫甚至更高等物种的转化载体(唐丽莉，等，2010)。
Table 1 piggyBac 类转座子的分布
宿主种类鉴定
分离方法
橘小实蝇 Bactrocera dorsalis
同源克隆
多蚤 Daphnia pulicaria
rRNA 基因 PCR
黑腹果蝇 Drosophila melanogaster
图 1 利用 piggyBac 转座子构建的家蚕种系转化的载体质粒图谱 图来源：TAMURA, T, et al.,2000
刘辉芬等在 2006 年利用 DNA 重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因 MaSp1 高度 重复序列进行多次重组，人工构建成 1.6 kb 的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因 Sil-E，DNA 序列分析证明了 人工基因序列的正确性。将家蚕 L 链基因启动子片段、L 链 cDNA、L 链基因终止子融合在一起，构 建成丝腺特异性表达单元。再与 Sil-E 融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元。将该 表达单元克隆到转座子 piggyBac 的转基因载体中，获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体。采用显 微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中。筛选转基因阳性个体，经 PCR 和 Southern 杂交鉴定， 结果表明目的基因整合到家蚕基因组中(刘辉芬，等，2006)，为进一步研究家蚕作为生物反应器表达 蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础。
2 转座子在基因工程中的应用
2.1 piggyBac 转座子
近年来，随着 DNA 转座子作为基因载体在动植物外源基因转化以及作为插入突变原和基因标签 在动植物基因分离和基因功能研究中的应用，DNA 转座子正逐渐成为研究热点。目前，已知的可作 为昆虫转基因载体的转座子主要有 P 转座子、Hermes 转座子、minos 转座子、hobo 转座子、mariner 转座子和 piggyBac 转座子，这些转座子都可作为转座载体获得转基因昆虫，但除了 piggyBac 外，大 多转座子的应用都存在一定的局限性(唐丽莉，等，2010)。piggyBac 转座子能在生物体染色体中准确 地切出和转座，适用范围较广，可在鳞翅目等多种昆虫中作为基因转移载体发挥作用(王建军，等， 2009)。 2.1.1 piggyBac 转座子的结构与作用机制
piggyBac转座系统的发展及应用
piggyBac转座系统的发展及应用张文豪1,2 李旭1,2 帅领1,2（1.南开大学 药物化学生物学国家重点实验室，天津300350；2.南开大学 药学院，天津 300350）·专题笔谈· 转座子是指在原核和真核生物基因组上可以进行位置转换的DNA片段。
转座子通过在原始位置上进行剪切或复制，经环化作用在转座酶辅助下插入到宿主基因组的其他位置，转座子发生位置转移的过程即为转座。
转座子可以在基因组任意插入和切除，常用于哺乳动物细胞基因编辑的研究之中。
相较于病毒介导的转染和传统转座子系统，piggyBac（PB）转座子拥有多种优点，广泛应用于转基因及功能基因研究中。
本文对转座子系统的发展历史、PB转座子的结构特点及最新研究进展进行阐述。
1 转座子系统简介 从1950年McClintock［1］发现玉米转座子后，科学家们又陆续在细菌、真菌和动植物等不同物种中发现了多种转座子，如细菌中的Tn5，酵母中的Ty和来源于鳞翅目昆虫的PB转座子。
1982年，Rubin和Spradling［2］将果蝇（drosophila）中发现的转座子P因子整合到果蝇染色体的其他位置，首次在昆虫中实现了转基因操作。
而1997年由Ivics等［3］通过生物信息学的方法重建了来源于鱼类的“睡美人（sleeping beauty，SB）”转座子，将其导入人的细胞中，开始了转座子系统在哺乳动物细胞中的研究。
通常基因工程所使用的转座子系统由3个部分组成：①转座子载体上有被转座酶特定识别的DNA序列；②用于筛选转座成功的标记基因或抗性基因（一般在转座子载体上）；③转座酶基因［4］。
目前为止，发现的转座子根据作用机制分为两种：逆转录转座子和DNA转座子。
前者具有类似逆转录病毒的结构，采用“复制-粘贴”机制，即先将自身DNA转录为RNA，然后在逆转录酶的作用下合成DNA，逆转录合成的DNA再插入染色体的其他部位。
而后者则采用“剪切-粘贴”机制，将转座子DNA从染色体上切下来后直接插入别的部位。
PiggyBac 转座子在细胞中的转基因研究
序号： 编码：
燕山大学
第十五届“世纪杯”大学生课外学术科技作品竞赛
作品申报书
作品名称： PiggyBac 转座子在细胞中的转基因研究
所属学院：
环境与化学工程学院
申报者姓名
(集体名称)：
查鑫华
类别：
■自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 □科技发明制作 A 类 □科技发明制作 B 类
依据现有资料表明，转座子具有高效的基因组间转移功能，
作品撰写的目 的和基本思路 结合目前国际上已有的一些研究报道，针对来自于昆虫的
PiggyBac 转座子系统进行改建，从基因启动子、靶基因序列
筛选以及转染方法等方面开展研究，探索新型高效的转动物技
术方法。
本课题采用现代先进的分子生物学技术，将 PiggyBac 转座
表情 论文题目 况 宿舍地址
PiggyBac 转座子在细胞中的转基因研610
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姓 名 性别 年龄
学院
专业 年级
刘瑞亮 男 其他 曾凡兴 男 作者 情况 张中峰 男
piggyBac转座子在哺乳动物中的应用
piggyBac转座子在哺乳动物中的应用杨冠恒;曾凡一【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(40)2【摘要】Since the resurrection of Sleeping Beauty (SB11), piggyBac(PB) is also described to work in mammals. DNA transposons are mobile genetic units identified in many mammals, can change the structures of genome and influence the function of special gene. The exogenous gene can be inserted into a new locus by transposase following a 'cut and paste' mechanism, so transposons have been widely used as tools to study the gene function, generate transgenic animals, and research gene therapy. Compared with SB11, PB has higher transposition level, no dose inhibition effect, and can carry larger fragments, thus PB has been cared more and more recently. Herein, we describe its mechanism of action,the factors influencing the transgenic effects,and the application in mammals.%转座子(transposon)是存在于生物体基因组中的可移动的DNA片段,能够影响基因的结构和功能,广泛存在于生物演化过程中.转座子通过切离和粘贴机制介导外源基因的插入,是研究基因功能,制备转基因动物及基因治疗的优良载体.目前在哺乳动物中转座活性较高且研究最多的是“睡美人”转座子和piggyBac(PB)转座子.前者是目前临床前基因治疗研究中使用最为广泛的转座子,但存在剂量抑制效应和转座效率低等缺陷.而PB转座子可克服剂量抑制效应,且转座高效,转基因载量大,因此在哺乳动物中的应用越来越广泛.作者就PB转座子的作用机制、影响因素及在哺乳动物中的应用现状等进行报道.【总页数】5页(P31-35)【作者】杨冠恒;曾凡一【作者单位】上海市儿童医院,上海200040;上海交通大学附属儿童医院医学遗传研究所,上海200040【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.转座子PiggyBac在哺乳动物中的应用 [J], 马元武;张连峰2.piggyBac转座子在畜牧兽医科学中应用研究进展 [J], 林丽梅;周世业;白丁平3.PiggyBac转座子及其在家蚕中的应用 [J], 赵岩龙;沈兴家4.piggyBac转座子在金鱼及泥鳅转基因中的应用 [J], 胡莹莹;郭学双;周阳;曹广力;贡成良;薛仁宇5.piggyBac转座子AgoPLE1.1在黑腹果蝇种系转化中的应用 [J], 张浩淼;王晓芳;罗光华;韩湘豫;王秋霞;韩召军;吴敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PiggyBac转座子:人类基因编码研究的新工具
PiggyBac转座子：人类基因编码研究的新工具于正洪;姜恩泽;张杰明【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2014(027)002【摘要】转座子是一种不依赖于同源性重组即可在宿主基因组中发生基因座位置改变的DNA片段.PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元素,并通过"剪切-黏贴"机制在有效载体和染色体之间调换.在换位过程中,PB转座子识别具体转座子的反向末端重复序列(inverted terminal repeat sequences,ITRS)位于转座子载体的2端,有效地移动原来位置的内容,并整合到TTAA染色体.PB转座子系统强大的活动使在PB载体上位于2个ITRS之间的基因容易地动员到靶基因.PB转座子因其高转座活性,转座安全、稳定与无痕移除的特性而备受关注,在分子医学研究中有较好的应用前景.针对其特性,PiggyBac转座子可被用于基因转移载体、癌基因筛选工具和基因治疗的载体.文中就其在基因编码研究中的应用作一综述.【总页数】4页(P199-202)【作者】于正洪;姜恩泽;张杰明【作者单位】210002,南京,南京军区南京总医院肿瘤内科;210008,南京,南京大学医学院;60611,芝加哥,美国西北大学文理学院【正文语种】中文【中图分类】Q343.1【相关文献】1.piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展 [J], 钟伯雄;危浩;庄兰芳2.PiggyBac转座子在肝脏中的活性研究 [J], 刘华华;缪辉;葛梦芸;吴传芳3.piggyBac转座子在畜牧兽医科学中应用研究进展 [J], 林丽梅;周世业;白丁平4.piggyBac转座子应用研究进展 [J], 杨欢欢;魏峰;刘全5.基于piggyBac转座子系统的西方蜜蜂Rubia基因转移研究 [J], 柯俐;胡小芬;王子龙;曾志将;何旭江因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
piggyBac转座系统——哺乳动物遗传分析的新工具
，
结节性硬化症基因 非翻译区
６
论文独创性声明
本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。
作者签名
日期
论文使用授权声明
ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｂ６ ｓｕｂｕｎｉｔ
整合素蛋白Ｂ６亚基
ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ
反向末端重复
ｌｏｎｇ ｉｎｔｅ嘲，ｅｎｅｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｌ锄∞＊ｌ
长散在重复元件－１
ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｏｃｙｔｅ－ｔｅｓｔｉｓ ｇｅｎｅ ｌ ｐｉｇｇｙＢａｃ ｐｉｇｇｙＢａｅ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｆＰＢ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｔｈｅ ｎｇｈｔ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｆＰＢ ｔｒａｎ￥ｐｏ￥ｏｎ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｎ２ Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
６８
维写表
ＡｃＮＰＶ Ａｃｔ ＢＧＨｐＡ ＣＭＶ ＥＮＵ ＥＳＴ ＦＢＳ ＧｍＮＰＶ Ｇｒｂｌ０ ＩＲＥＳ Ｉｔｇｂ６ ＩＴＲ Ｌ玎ｑＥＩ
（Ｌ１）
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Ａ
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∥
裟蒜飘一兰黑鬻篡
缩写表
＾ｆ蜘呐强１‘蛔１。“”１“ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒
转座子已在低等生物中被有效用于大规模地转基因和基因诱变分析，在对酵 母、线虫和果蝇等模式生物的基因功能研究中起了重要作用。然而，由于缺少高 效的转座系统，在哺乳动物中转座子的运用还相当有限。
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中图 分 类 号 ： ８ Ｑ７ ２ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ７５ ３ （ ０ ０ １ － ０ １０ １ ０ —０ ８ ２ １ ） ２ ０ ９ － ４
转座 子是一 类能在 宿 主基 因组 中变 更插 入 位 置 的 可移动 遗传 因 子 ， 变 更 插 入 位 置 的 过 程 被 称 为 其 转座 。 自 １ ５ 年 美 国 Ｍｃｉｔｃ ９１ ｌ ｏ ｋＢ在玉 米 中发现 了 ｎ 第一个 转 座子 以来 ， 座 子 被 发 现存 在 于 大 多数 的 转 微 生物 和动植 物类 型 中 ， 从噬 菌体 到 线虫 、 昆虫 和 到 人 ， 到玉米 和水稻 ， 些生物 的基 因组 中都 留下 了 再 这
律， 能够被 稳定 地 转 移 到 下 一代 等 特 点 而 受 到 重 视
和关 注 。
１ ｐｇ ｙ ａ 转 座 子 的基 本 结 构 ｉｇ Ｂ ｃ
ｐｇ ｙ ａ 转 座 子 是 来 源 于 鳞 翅 目 昆 虫 的 ＤＮＡ ｉｇ Ｂ ｃ 型 转 座 子 ， 毒 遗 传 学 家 Ｆ ａｅ Ｊ和 同 事 们 在 杆 病 ｒ ｓｒＭ
有 标记 的转 座子 插 入 目的基 因或 基 因组 ， 生 了转 产
座 子 标 签 技 术 、 座 子 定 点 杂 交 技 术 、 座 子 基 因 打 转 转
状 病 毒 （ ａ ｕｏ ｉ ｓ 侵 染 粉 纹 夜 蛾 （ ｒｃ ｏ ｌｓ Ｂ ｃ ｌｖｒ ） ｕ Ｔ ｉｈ ｐ ｕ ｉ ａ ｎ ） Ｔ ３ ８ 细 胞 株 系 时 首 次 分 离 得 到 ｉ Ｎ一６
Ａｂ ｔａ ｔ Ａｎ ｉｅ ｉ ｐｔ ｐ ｓｗｈｃ ｒ ｈ ｊ ｒｆ ｎ ｔｏ ａ ｎ ｔ ａ ｆｅ ｔ ｅｙ ｓｉ ｌｔ ｈ ｏ ｔ Ｓｃ ｌ — ｓｒ ｃ ： ｔ ｎｃｅ ｉｏ ｅ ｉｈ ａ ｅｔ ｅｍａｏ ｕ ｃｉｎ ｌｕ ｉｓｃ ｎｅ ｆｃｉ ｌ ｔ ｇ ｖ ｍｕａ ｅｔ ｅｈ ｓ ’ ｅｌ ｕ
动 物 医 学 进 展 。０ ０ ３ （ ２ ：１９ ２ １ ， １ １ ） ９ —４
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖ ｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｉ ｉ ｅ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎ ｒ ｄｃｎ
ｐｇ ｙ ａ 转 座 子 应 用 研 究 进 展 ｉｇ Ｂ ｃ
杨 欢 ｈ ａ ，ＬＩＣｈ ｎ ｌ ｇ Ｉ Ａｉ ｉ ｇ，ＹＡＮ Ｇ Ｄｏ ｇ ｘ ａ Ｓ ｕｉ ｕ —ｉ ，Ｊ Ａ ～ ｎ ｎ ｑ ｎ — ｉ ，ＬＩＭ ｉ ｏ ａ
（ ａ ｇ ｏ ｇＯｐ ｎＬ ｂ ｒ ｔｒ ｆ Ｖ ｔｒｎ ｒ ｂｉ Ｈｅ ｌ Ｇｕ ｎ ｄ ｎ ｅ ａ ｏａ ｏ ｙ ｏ ｅ ｉ ａ ｙ Ｐｕ ｌ ａｔ ｅ ｃ ｈ，Ｉ ｓｉ ｔ ｆ Ｖ ｔｒｎ ｒ ｄ ｃｎ ｎ ｔ ｕ ｅ ｅｅ ｉａ ｙ Ｍｅ ｉｉｅ， ｔ ｏ Ｇｕ ｎ ｄ ｎ ａ ｇ ｏ ｇＡｃ ｄ ｍｙ ｏ ａ ｅ ｆＡｇ ｉ ｌ ｒ ｌＳ ｉ ｃ ，Ｇ ａ ｇ ｈ ｕ Ｇ ａ ｇ ｏ ｇ， １ ６ ０ Ｃ ｉａ ｒｃ ｔ ａ ｃｅ ｅ ｕ ｎ ｚ ｏ ． ｕ ｎ ｄ ｎ ５ ０ ４ ， ｈ ｎ ） ｕ ｕ ｎ
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Ｐｒ ｇ ｅ ｓ Ｏ ｌＡ ｐ ｏ ｃ ｅ ｏ ｏ ｒ ｓ ｉ ｐｒ ａ ｈ ｓ ｆ ｒ Ａｎｔｇ ｎ Ｅｐｉｏ ｔ ｄ ｉｅ ｔ ｐｅ Ｓ ｕ ｙ
收 稿 日 期 ：０ ００ — ９ ２ １ — ５ １
基 金 项 目 ： 家 自然 科 学基 金 项 目（ ０ ７ １ ８ ； 家科 技 支撑 计 划 项 目（ Ｏ Ｏ Ａ Ｏ Ｂ １ 国 ３９２７） 国 ２ １Ｂ Ｄ ４ Ｏ ） 作 者 简 介 ： 欢 欢 （ ９ Ｏ ） 女 ， 江德 清人 ， 士 研 究生 ， 杨 １８ 一 ， 浙 硕 主要 从 事 分 子 寄 生 虫 学研 究 。 ＊通 讯 作 者
ｐｇ ｙ ａ ｉｇ Ｂ ｃ转座子 已成 为在 昆 虫中应 用 最 广泛 的 转座 子 之 一 。近年 来 国 内外研 究 者 更将 其 应 用领 域 拓 宽 到 了鱼 类 ， 寄生 虫和 哺乳动 物 等转基 因研 究 中。 随 着对 ｐｇ ｙ ａ ｉｇ Ｂ ｅ转座 子 功 能 和分 布 的 深入认 识 ， ｉｇ Ｂ ｃ转 ｐｇ ｙ ａ 座子将 更 多应用 于基 因功 能研 究 ， 因治 疗 ， 基 转座 子介 导 的细胞 系基 因诱 变及基 因工程 蛋 白表达 等基础 研 究
最 早 被 称 为 Ｉ Ｐ 的 转 座 子 。 在 越 来 越 多 的 研 Ｆ ２ 现
靶 技术 和非病 毒 载体 基 因增 补 技 术 等 ， 已使 转 座 早
子成 为 了各种 生物基 因分 析 的有 效工 具 ［ 。随着基 １ ］
因工 程 和 功 能 基 因 组 学 的 发 展 ， 座 子 正 逐 渐 成 为 转
（ ． 国人 民解 放 军 军 事 医 学科 学 院 军 事 兽 医 研 究 所 ， 林 省 人 兽 共 患 病 预 防与 控 制 重 点 实 验 室 ， １中 吉 吉林 长 春 １ ０ ６ ３０２
２吉林农业大学生命科学学 院， ． 吉林 长 春 １ ０ １ ） ３ １８
摘
要 ：ｉｇ Ｂ ｃ转 座 子 是 来 源 于 鳞 翅 目 昆 虫粉 纹 夜 蛾 （ ｒｃ ｏ ｌ ｓ ｉ ｐｇ ｙ ａ Ｔ ｉ ｐ ｕ ｉ ｎ ）的 Ｄ ｈ ａ ＮＡ 型 转 座 子 。 目前
转 座 子 的 足 迹 。 利 用 转 座 子 特 有 的 转 座 功 能 ， 带 将
研究 热点 。其 中尤 以 ｐｇ ｙ ａ ｉｇ Ｂ ｃ转 座 子 具 有 转 座 时 携带 目的基 因不 受 大小 限制 ， 目的基 因能 够 在 基 因 组 中表达 ， 而且 表达 具有 遗传性 ， 循孟 德 尔遗 传 规 遵