转座子的插入突变及转座子的应用

质粒拯救法
质粒拯救法是转座子应用于分子生物学研究后 应用最广泛的转座子插入位点周围序列鉴定的方 但这种方法实验周期比较长， 操作相对繁琐， 法。但这种方法实验周期比较长， 操作相对繁琐， 为保留选择标记， 为保留选择标记， 有时适宜的限制性内切酶的选 取非常困难。 取非常困难。对于一个突变体中有多处转座子插 入的研究以及需要鉴定的突变体数量众多的研究 而言， 这种方法不是一个理想方法。 而言， 这种方法不是一个理想方法。
二、转座子的分类
（一）简单转座子（插入序列，IS） 简单转座子（插入序列， ） 结构特征： 结构特征： 1、含短的末端反向重复序列（ 15-25bp）; 、含短的末端反向重复序列（ ） 2、含编码转座酶的基因; 、含编码转座酶的基因 3、靶位点存在 5-9 bp 的短正向重复序列。 、 的短正向重复序列。
转座子的插入突变及转座子 的应用
主讲人:杨长友 主讲人 杨长友 本组成员:杨菊 本组成员 杨菊 孙青芝 陈骊君 陆朝军 杨长友
内容提要
一、转座子的发现 二、转座子的分类 三、转座子的转座机制 四、转座子的遗传效应 五、转座子插入位点的鉴定方法 六、转座子的应用
一、转座子的发现
转座子（ 简称Tn） 转座子（transponson,简称 ）, 又称易 简称 位子，是指存在于染色体DNA上可以自主 位子，是指存在于染色体 上可以自主 复制和位移的一段DNA序列。 序列。 复制和位移的一段 序列 转座子可以在不同复制子之间转移， 转座子可以在不同复制子之间转移，以非 正常重组方式从一个位点插入到另外一个 位点， 位点，对新位点基因的结构与表达产生多 种遗传效应。 种遗传效应。
一、转座子的发现
• 转座子是1951年美国玉米遗传育种学家 转座子是 年美国玉米遗传育种学家 Mcclintock最早发现的，是针对玉米籽粒 最早发现的， 最早发现的 色斑不稳定现象而提出来的 而提出来的。 中色斑不稳定现象而提出来的。 • 当时这是一个新概念，它突破了以往人们 当时这是一个新概念， 认为基因在染色体上的位置是固定不变 基因在染色体上的位置是固定不变的 认为基因在染色体上的位置是固定不变的 认识，所以一开始并不被大家接受， 认识，所以一开始并不被大家接受，直到 1967年在大肠杆菌 ．coli)的半乳糖操纵 年在大肠杆菌(E． 年在大肠杆菌 的半乳糖操纵 子研究中发现了这类插入序列，才得以被 子研究中发现了这类插入序列， 插入序列 普遍认同。 普遍认同。
转座子末端被交错剪切
另一条链也被切
受体也被交错切割
供体被释放
Tn 连 接 到 靶 上
43 T n 的 两 条 链 先 后 被 切 割 ， 然 后 转 座 子 与 切 开 的 靶 位 点 连 接 。
（二）复制 型转座
特征： 特征： 1、转座后原 来位置上的 转座因子保 持不变； 持不变； 2、转座过程 中有一共整 中有一共整 合体。 合体。
4、生态环境污染的生物修复 、
由于基因的可变性及转座子的遗传调 由于基因的可变性及转座子的遗传调 控， 许多微生物能够利用人工合成的 化学物质， 化学物质，与微生物分解代谢相关的 基因往往与插入元件相连。 基因往往与插入元件相连。当环境污 染时，子转移频率提高，增加了 微生物种群的生物降解潜力。 微生物种群的生物降解潜力。
三、转座子的转座机制
据转座子的移动机制，转座可分为： 据转座子的移动机制，转座可分为： （一）复制型转座 （二）非复制型转座
转 座 酶 结 合 在 Tn 两 端
（一）非复 制型转座
特征 1、断裂和重 、 接反应使靶 重构。 重构。 + 2、供体保持 、 裂缺。 裂缺。 3、不形成剪 切 释 放 交换结构经 共 、不形成共 后导致非复制型转座子插入到靶 整合体。 整合体。 供 体 留
Tn
从 3’ 末 端 复 制 产生共合体
靶
单链交错切割
共合体
重组
转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接 交 叉 结 构 (单 链 转 移 复 合
四、转座的遗传学效应
（1）插入突变失活或改变基因表达的 ） 模式。 模式。
插入突变失活是转座的最直接效应， 插入突变失活是转座的最直接效应，但 转座也可以通过干扰宿主基因与其调控元件 之间的关系或改变DNA的结构而影响基因的 之间的关系或改变 的结构而影响基因的 表达。 表达。
一、转座子的发现
• 现在的研究说明，在生物界中转座子 现在的研究说明， 是普遍存在的，并认为在生物的遗传 是普遍存在的，并认为在生物的遗传 进化方面有重要作用 有重要作用。 进化方面有重要作用。转座子从一个 位置转座到另一个位置的转入和切出 过程，改变了原有基因的结构和排序 原有基因的结构和排序， 过程，改变了原有基因的结构和排序， 从而产生了突变。 从而产生了突变。 • 目前生物体中所发现的 ％的突变是 目前生物体中所发现的10％ 由于它抑制其他基因的表达而形成的。 由于它抑制其他基因的表达而形成的。
2、构建突变体库 、
正因为以上转座子的特征， 正因为以上转座子的特征，转座子才 被广泛应用于构建插入突变体库 插入突变体库， 被广泛应用于构建插入突变体库，现 已成为研究基因功能的重要手段之一。 已成为研究基因功能的重要手段之一。 目前研究和应用得较多的有Tn10、 目前研究和应用得较多的有 、 Tn5、Tn3和Mu噬菌体 。 、 和 噬菌体
3、鉴别菌株及群体多样性 、
转座子通常限制性地分布于特定的真 菌菌株或群体中， 菌菌株或群体中，可以作为特定菌株 诊断工具， 的诊断工具，已用于丝状真菌群体多 样性分析。在医药工业方面已用于有 样性分析。在医药工业方面已用于有 益菌株的鉴别， 在植物病理学方面已 益菌株的鉴别， 用于鉴别特定的病原 用于鉴别特定的病原 。
反向PCR法
• 该方法的操作步骤为，提取转座子插 该方法的操作步骤为， 入形成的突变体的染色体， 入形成的突变体的染色体，用适宜的 限制性内切酶消化后 消化后， 连接酶进行 限制性内切酶消化后，用连接酶进行 酶切片段的分子内自连， 酶切片段的分子内自连，然后用一对 位于转座子上的外向型引物进行PCR 外向型引物进行 位于转座子上的外向型引物进行 扩增， 产物直接测序或克隆在T 扩增， PCR产物直接测序或克隆在 产物直接测序或克隆在 载体上测序， 载体上测序， 获取转座子插入位点周 围序列的信息。 围序列的信息。
2、构建突变体库 、
转座子具有可选择的抗性标记而容易在体 转座子具有可选择的抗性标记而容易在体 可选择的抗性标记 内鉴定突变， 内鉴定突变，经转座子诱变的突变子含有 已知的DNA片段，可以通过转座子序列的 片段， 已知的 片段 杂交来鉴定突变基因的位置， 杂交来鉴定突变基因的位置，经转座子诱 变的突变体具有高度的极性 高度的极性， 变的突变体具有高度的极性，使得被诱变 的基因以及同一操纵子内的下游基因完全 丧失功能。 丧失功能。
5、转基因生物的克隆 、
在细胞工程中， 在细胞工程中，转座子可作为有力的工具 和基因载体系统用于克隆转基因生物。 和基因载体系统用于克隆转基因生物。基 因组插入质粒P因子已成功克隆转基因果蝇 因子已成功克隆转基因果蝇。 因组插入质粒 因子已成功克隆转基因果蝇。 通常认为， 通常认为，转座子的插入能引起新的突变 体形成， 体形成，但其副作用也许会抵消由转基因 提供的任何优势，以可移动DNA片段作为 提供的任何优势，以可移动 片段作为 载体尚存在转移基因结果的不稳定现象和 内源跳跃基因的相互影响。因此， 内源跳跃基因的相互影响。因此，这方面 的应用还处于探索阶段。 的应用还处于探索阶段。
1、基因的标定 、
若要获得引起新突变的未知基因， 若要获得引起新突变的未知基因， 未知基因 随机诱变策略(非目的诱变 则用随机诱变策略 非目的诱变)， 则用随机诱变策略 非目的诱变 ，即将 带有功能性转座因子的显性纯合系植株 与不带转座因子的同种植株杂交， 与不带转座因子的同种植株杂交，产生 子代再自交， 的F1子代再自交，在F2代中就可筛选到 子代再自交 代中就可筛选到 转座子随机插人引起突变表型的突变株， 转座子随机插人引起突变表型的突变株， 然后选择感兴趣的新突变株进行研究。 然后选择感兴趣的新突变株进行研究。
二、转座子的分类
（二）复合转座子 结构特征： 结构特征： (1)中间区域含编码转座酶以外的标记基因； (1)中间区域含编码转座酶以外的标记基因； 中间区域含编码转座酶以外的标记基因 (2)两端具有插入序列； (2)两端具有插入序列； 两端具有插入序列 (3)两末端是反向重复序列； (3)两末端是反向重复序列； 两末端是反向重复序列 (4)靶位点存在短正向重复序列。 (4)靶位点存在短正向重复序列。 靶位点存在短正向重复序列
五、转座子插入位点的鉴定方法
质粒拯救法
反向PCR法 法 反向
质粒拯救法
该方法的操作步骤为， 该方法的操作步骤为，将转座子插入后形 成的突变体的染色体或质粒DNA用限制性内 成的突变体的染色体或质粒 用 消化， 切酶消化 凝胶电泳分离后， 切酶消化，凝胶电泳分离后，以转座子上的片 段为探针， 杂交， 段为探针， 进行 Southern杂交， 确定转座 杂交 子插入位点所在片段的大小， 子插入位点所在片段的大小， 即在电泳分离 条带上所处的位置。 条带上所处的位置。 然后将这一部分DNA回收， 连接在如 回收， 然后将这一部分 回收 pUC18等克隆载体上，转化大肠杆菌， 并根 等克隆载体上， 等克隆载体上 转化大肠杆菌， 据一定的基因标记 基因标记筛选克隆有转座子插入位点 据一定的基因标记筛选克隆有转座子插入位点 的片段的菌株。 的片段的菌株。
六、转座子的应用
基因的标定
构建突变体库 鉴别菌株及群体多样性 生态环境污染的生物修复 转基因生物的克隆
1、基因的标定 、
所要分离和克隆的基因不同， 所要分离和克隆的基因不同，在定 位和标定时所用的方法也不同。 位和标定时所用的方法也不同。若要获 得感兴趣的己知目的基因 则采用目的 己知目的基因， 得感兴趣的己知目的基因，则采用目的 诱变策略， 诱变策略，即用一个稳定遗传的隐性纯 合体与一个带有活跃转座子的显性纯合 体杂交，可以在F1代标定目的基因 代标定目的基因。 体杂交，可以在 代标定目的基因。