转座子插入敲除
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
基因敲除技术
基因敲除技术gene knockoutgene knockout简介基因敲除技术是一种通过破坏特定基因来研究该基因在细胞或生物体中功能的实验方法。
这项技术在基础研究、疾病模型构建以及药物开发等领域中起着重要作用。
通过敲除特定基因，我们可以揭示该基因在生物体中的功能，对其与相关疾病的关联进行研究，并探索其在生物学过程中的作用机制。
基因敲除技术的原理基因敲除技术是通过引入特定的DNA片段使目标基因发生突变或被删除，从而破坏目标基因的功能。
常用的基因敲除技术包括CRISPR/Cas9、转座子、RNA干扰等。
CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因敲除技术之一。
它基于细菌和古菌的天然免疫系统中的一种防御机制。
CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由短重复序列和变异序列组成的DNA片段。
Cas9是一种具有核酸内切活性的酶。
CRISPR/Cas9技术利用RNA导向的Cas9酶靶向识别和切割特定的DNA序列。
在细胞中引入含有目标基因的RNA分子和Cas9酶后，Cas9酶会与RNA分子结合形成复合物，通过RNA分子的导向，使Cas9酶与目标基因特异性结合，并切割目标基因的DNA序列，导致基因发生突变或敲除。
转座子转座子是一种能在基因组中移动的DNA片段。
转座子可以在基因组中发生插入、删除或重排等事件，从而导致基因的敲除和突变。
转座子技术通过引入含有转座子序列的DNA片段来实现基因敲除。
在细胞中，转座子序列会与基因组发生重组，导致目标基因的敲除或突变。
RNA干扰RNA干扰是一种通过介导靶向特定mRNA分解的机制来抑制基因表达的方法。
在RNA干扰中，特定的siRNA（small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）分子与目标mRNA相互作用，导致mRNA的降解，从而抑制特定基因的表达。
【分享】基因敲除细胞株构建流程
【分享】基因敲除细胞株构建流程如果选择的方法不对，或者细胞株不对，不同的细胞株做基因敲除细胞系的改造会有什么变化呢？筛选细胞是基因敲除细胞成败的重要环节！如果没有正确的方法那么基因敲除的细胞株工作就不能顺利的进行，首先要知道影响基因敲除细胞系的主要关键点是什么？其次是要了解和熟悉具体的实验流程和实验步骤，让自己轻松的完成基因敲除细胞株的构建流程。
一. 如何选择基因敲除的细胞：1.关键点：支原体污染在绝大部分的实验室里都不太被重视，如果支原体污染了细胞，则会导致细胞产生很多问题：如细胞的增殖问题，同时还会影响细胞的代谢，产生的数据也会有很大的误差，所以在实验室里的技术人员都需要非常重视。
2.检测方法有两种：细胞培养和PCR鉴定。
3.基因敲除的优势：克隆形成率高，敲除效率高，细胞容易增殖，但是有一个例外就算是做了细胞基因敲除株的构建，也无法获得基因敲除的单克隆细胞，那就是没有多基因的问题；染色体不突变；难增殖的细胞；细胞的数量有限；做基因敲除细胞株难以得到纯合子敲除的细胞系的原因就是克隆的拷贝数太多。
4具体原因：只能是肿瘤细胞系，不能是永生细胞系，往往很多永生细胞系做起来都比较有挑战性，当在做基因敲除细胞株时，如果敲除效率是x，则拷贝数是n，那么纯合敲除的效率就是：x^n，可见效果就不显著了。
二. 基因敲除细胞系的敲除方法：1.建议首选：如果只是做常规的移码敲除，那么一个细胞里面只有2个基因位点，是很难保证两个基因位点是一样的移码，所以得到移码的数据也不同，当你在鉴定测序看图的时候就没有那么清晰，所以，选择片段敲除是一个较为有效的办法。
2.关键点：移码敲除在很多时候并不彻底，会在后续的实验中出现Western Blot的问题，出现神秘的条带，大片段的基因敲除是几kb的缺失，mRNA就没有目的蛋白的转录，Western Blot问题也解决了，鉴定敲除方法：纯合敲除细胞系，比移码敲除效率更高。
3.如何判断是大片段敲除的细胞系：主要是通过目的基因片段对PCR扩增的方式判断。
基因敲除技术及其进展
基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用The Current Status of Gene Knockout and its Application in MetabolicEngineering天津大学化工学院二零壹六年六月摘要基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。
本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。
并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。
关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, homologous recombination, CRISPR/Cas9目录第一章基因敲除技术 (1)1.1基因敲除相关背景 (1)1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用 (2)第二章基因敲除策略 (3)2.1传统的基因敲除策略 (3)2.1.1利用同源重组进行基因敲除 (3)2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除 (4)2.2新兴的基因敲除策略 (5)2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除 (5)2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术 (5)2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术 (6)2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术 (7)第三章前景展望 (9)参考文献 (10)致谢 (11)第一章基因敲除技术1.1基因敲除相关背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。
如何在基因编辑中实现基因组片段的插入
如何在基因编辑中实现基因组片段的插入基因编辑是一种新兴的技术，可以对生物体的基因组进行精确的修改。
在基因编辑中，实现基因组片段的插入是一个重要的任务。
本文将介绍如何在基因编辑中实现基因组片段的插入，并探讨该技术的应用前景。
基因组片段的插入是指将外源的DNA片段或基因序列精确地嵌入到目标生物体的基因组中。
这种插入可以用于多种目的，例如增加或改变特定基因的功能，研究基因的功能机制，以及治疗某些遗传疾病等。
目前主要有三种方法可以实现基因组片段的插入：使用转座子系统、利用CRISPR-Cas9系统和基因修复机制。
转座子系统是一种天然存在于多种生物体中的基因移动工具。
转座子是一段可以从一个位置移动到另一个位置的DNA序列。
通过将所需的基因组片段嵌入到转座子中，然后利用转座子的特性将其插入到目标基因组中，可以实现基因组片段的插入。
这种方法的优点是高效、稳定，适用于多种生物体。
然而，由于需要使用特定的转座子，该方法在一些生物体中的应用受到限制。
CRISPR-Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，具有高效、精确和方便的特点。
该系统利用一种细菌的天然防御机制，可以精确剪切基因组中的特定DNA序列。
通过设计特定的引导RNA，可以将CRISPR-Cas9系统引导到目标基因组中的特定位置，然后利用Cas9酶的切割功能，将外源的基因组片段插入到目标基因组中。
CRISPR-Cas9系统的优点是操作简单、效率高，可以用于多种生物体中的基因编辑。
然而，该系统也存在一些局限性，例如可能引发意外的剪切和插入事件，以及可能引发基因组不稳定性等问题。
基因修复机制是细胞为修复损伤的DNA而存在的一种机制。
在基因编辑中，可以利用细胞的基因修复机制实现基因组片段的插入。
通过设计特定的DNA片段，例如同源重组修复体，可以引导细胞利用同源基因修复机制将外源的基因组片段插入到目标基因组中。
这种方法的优点是不需要外源工具，而且可以在细胞中实现高效和准确的插入。
以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用
以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用武有聪;孟媛媛;丁百兴;韩海燕;瞿涤;白丽【摘要】葡萄球菌是医院内感染的重要病原菌,通过同源重组敲除葡萄球菌的靶基因是研究其功能的重要方法.以质粒为基础的重组系统是外源基因序列传递,发生同源重组的重要载体.近年来,葡萄球菌基因敲除所用的重组质粒的特性取得不断改进.结合本课题组工作,简要综述以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用及技巧,重点比较不同质粒的特点及使用条件,对于葡萄球菌致病机制研究具有借鉴意义.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2019(035)007【总页数】6页(P581-586)【关键词】质粒;同源重组;基因敲除;葡萄球菌【作者】武有聪;孟媛媛;丁百兴;韩海燕;瞿涤;白丽【作者单位】大理大学基础医学院病原生物学综合实验室,大理671000;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;大理大学基础医学院病原生物学综合实验室,大理671000;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;大理大学基础医学院病原生物学综合实验室,大理671000【正文语种】中文【中图分类】R382.5研究细菌基因功能的方法主要有基因敲除(基因组中直接去除某基因，位点特异)、反义RNA干扰(降低mRNA表达量，影响因素多)、转座子插入突变(插入位点随机，筛选繁琐，存在多位点插入突变)、基因过表达等技术，但最可靠而常用的方法仍是基因敲除[1-2]，即选择合适的质粒，将靶基因两侧的同源序列克隆至载体上，转入宿主菌后通过同源重组实现对靶基因的置换敲除。
由于微生物的多样性，将外源DNA导入宿主菌并完成同源重组的策略也千差万别。
目前，未见有适合于多种宿主菌基因敲除的通用重组系统的报道。
转座子插入敲除
特点：
• 1、所有生物的染色体都有转座子 • 2、转座相关序列可以占据物种基因的很大
一部分，如人和玉米基因组的50%以上是由 转座相关序列组成 • 3、转座子的含量在不同基因组中变化很大 • 4、当转座子移位时，转座因子通常对插入 位点几乎没有序列选择性
a
4
转座子类型：
• 1、DNA转座子 • 2、类病毒反转录转座子 • 3、聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子
• 一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲 掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成 容易识别的表型，因为基因家族的其他成 员可以提供同样的功能；
• 另一方面，对于某些必需基因，敲除后会 造成细胞的致死性，a也就无法对这些必需 13
•转座子(transposon)是存在于DNA上可自 主复制和移位的基本单位。 •由Barbara McClintock 在20世纪40年代首 次从玉米中发现，从此改变了人们对基因 组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在 染色体上呈线性固定排的传统理论。 •1983年McClintock因发现转座子被授予诺 贝尔奖
机插入突变，建立一个携带随机插入突变
的细胞库，然后通过相应的标记（如Tn5转
座子含kan抗性基因）进行筛选获得相应的
基因敲除细胞。
a
8
a
9
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10
• 睡美人转座子(sleeping bueaty,转座子SB)已证明在小鼠和人 细胞中可以激活,转座子插入新的位点后，该位点附近的基 因即受到抑制呈现隐性的“睡美人”表型。
• 一旦转座子在转座酶的作用下从这一位点上转走，该位点的 基因隐性表型又恢复为显性表型，即“睡美人苏醒”。调控 转座酶和转座子活性的系统称为青蛙王子(Frog Prince)。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
1. 同源重组在G+球菌基因敲除中的运用
同源重组在细菌基因敲除中的运用
• 基因功能研究方法
– 计算机预测基因功能 – 基因失活
• 基因敲除knock out • 转座子插入突变 • 反义RNA技术（RNA沉默）：knock down
– 基因过表达（over-expression） – 酵母双杂交（yeast two-hybridization）
细菌的生物学特点
• • • • • 个体微小 结构简单：单细胞生物 易于培养 繁殖快：代时仅20-30min 具有一条染色质（无内含子），单倍型
• 细菌是生命科学研究重要的模式生物
细菌的遗传变异现象
• 遗传（heredity): 子代与亲代之间生物学 性状具有相似性。使细菌的性状保持相对 稳定，且代代相传，使其种属得以保存。 • 变异(variation)：在一定条件下，若子代 与亲代或子代与子代之间的生物学性状出 现差异。变异使细菌产生变种和新种，以 利于细菌的生存及进化。
表皮葡萄球菌saeRS敲除
4. 运用pKOR1质粒敲除G+球菌基因
Map of pKOR1
pKOR1质粒特点
• A replacement plasmid that employs antisense secY RNA expression (secY expression are essential for bacterial growth and survival) for counter-selection （obviated the need for antibiotic marker selection） • The lambda recombination cassette (Invitrogen) is another feature of pKOR1 that permits rapid cloning of mutant alleles without the use of restriction enzymes and ligases
转座子插入突变体库构建流程
转座子插入突变体库构建流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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tn5转座子原理_理论说明以及概述
tn5转座子原理理论说明以及概述引言部分内容示例：1. 引言1.1 概述本文旨在探讨tn5 转座子的原理、理论说明以及其在相关领域中的应用。
对于转座子这一概念，它是指生物体内部或不同个体间基因组DNA序列移动或重排的过程。
tn5 转座子作为一种广泛存在于细菌中的转座子，具有独特的结构和功能，在生命科学领域中具有重要的研究意义和应用前景。
1.2 文章结构本文共分为五个主要部分进行阐述，分别是引言、tn5转座子原理、理论说明、实验验证与研究进展以及结论。
下面将逐一介绍各个部分内容，并给出相应章节的概览。
1.3 目的通过撰写这篇文章，旨在全面解析tn5 转座子在转座反应中所起到的关键作用和功能机制，并从理论上对其进行深入探讨。
同时，详细说明了tn5转座子在实验验证和研究进展方面的最新成果，并展望未来发展方向。
通过本文，希望能够增加读者对tn5 转座子的理解，并为相关领域的研究者提供重要的参考资料和思路。
2. tn5转座子原理2.1 转座反应概述转座是指基因组中的DNA序列从一个位置移动到另一个位置的过程。
tn5转座子是一种广泛存在于细菌和真核生物中的转座子，它可以在基因组中发生自由或复制式的转座反应。
2.2 tn5转座子的结构与功能tn5转座子由两个关键部分组成：外翻酶（transposase）基因和IRs（inverted repeats）序列。
外翻酶是负责催化DNA切割和连接的酶，IRs序列则是在转座反应过程中提供结构支持和识别特定位点的重要元素。
tn5转座子通过外翻酶将自身从一个位置切割出来，并插入到新的目标位点上。
在这个过程中，外翻酶首先结合到IRs序列上，并切割出tn5转座子与目标DNA 之间的连接部分。
然后，外翻酶会介导tn5转座子在目标位点上生成一个“缺口”，并将其紧密地连接到目标DNA上。
2.3 转座机制解析tn5转座子的具体机制可以分为两步：切割与连接。
在切割步骤中，外翻酶首先结合到IRs序列上，并识别目标位点。
pk18mobsacb敲除原理
温馨小提示：本文主要介绍的是关于pk18mobsacb敲除原理的文章，文章是由本店铺通过查阅资料，经过精心整理撰写而成。
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愿本篇pk18mobsacb敲除原理能真实确切的帮助各位。
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pk18mobsacb敲除原理（大纲）一、pk18mobsacb概述1.1pk18mobsacb的定义1.2pk18mobsacb的作用与功能二、基因敲除技术简介2.1基因敲除的原理2.2常见基因敲除方法三、pk18mobsacb敲除原理3.1敲除策略3.1.1选择性敲除3.1.2非选择性敲除3.2敲除方法3.2.1CRISPR/Cas9技术3.2.2RNA干扰技术3.2.3转座子插入技术四、pk18mobsacb敲除效果评估4.1敲除效率4.2敲除特异性4.3敲除稳定性五、应用与前景5.1pk18mobsacb敲除在生物研究中的应用5.2未来发展方向与挑战六、总结6.1研究成果6.2不足与改进方向一、pk18mobsacb概述PK18mobsACB是一种人工合成的双链RNA分子，用于敲除特定的基因。
在基因敲除领域，PK18mobsACB因其高效、特异性的基因沉默效果而被广泛应用。
PK18mobsACB的主要作用是通过与目标基因的mRNA分子结合，阻止其翻译过程，从而实现基因的沉默。
具体而言，PK18mobsACB可以与目标基因的mRNA形成双链RNA复合物，阻碍了翻译机器对mRNA的识别和翻译，导致目标基因无法产生相应的蛋白质，从而实现了对目标基因的敲除。
反向遗传学及其相关技术(1)
先用化学诱变剂(甲基磺酸乙酯，EMS)诱发产生 一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行 PCR扩增，然后将PCR扩增产物变性和退火形成 异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶 CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺 凝胶(PAGE)电泳检测分析。
需要知道所研究基因的序列。
2）随机插入突变
A. T-DNA插入突变 以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究 方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异 等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因 并鉴定其功能。
构建T-DNA载体→转化→突变体的筛选及遗传分 析→分离T-DNA 插入位点的侧翼序列→基因的 定位、结构与功能分析。
4. 重复序列：外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上， 形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复， 则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这 种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对， 甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑 制其表达。
B. 转座子插入突变
利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞 基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入 突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相 应的基因敲除细胞。
由转座子引起的突变可以转座传学及其相关技术
一、概述
（一）遗传研究的二条途径
1、表→里：正向遗传学研究 杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在 的基因及数目→基因的功能及作用性质。 这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究 遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向 遗传学采用的研究方法。
2、里→表：反向遗传学研究
基因突变和突变体的形成
转座子突变：转座子插入或删除导致的基 因突变
基因突变的特征
随机性：基因突变发生在细胞分裂过程中，具有随机性。 低频性：基因突变在生物群体中的发生频率较低。 多样性：基因突变可以导致多种多样的突变类型，如碱基替换、插入、删除等。 可逆性：某些基因突变可以通过修复机制得到修复，恢复到原始状态。
基因突变与农业育种
基因突变在农业育 种中的应用
基因突变可以提高 作物的产量和品质
基因突变可以提 高作物的抗病性、 抗虫性和抗逆性
基因突变可以改良 作物的性状，如颜 色、形状、口感等
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诱导突变 体：通过 物理、化 学或生物 因素诱导 产生的基 因突变
转座子突 变体：转 座子插入 或删除导 致的基因 突变
染色体畸 变突变体： 染色体结 构改变导 致的基因 突变
基因敲除 突变体： 通过基因 工程技术 敲除特定 基因产生 的突变体
基因替换 突变体： 通过基因 工程技术 替换特定 基因产生 的突变体
基因检测：通过基因检测了 解自身基因状况，采取针对 性的预防措施
基因突变与疾病治疗
基因突变与疾病的关系：基因突 变可能导致疾病，如癌症、遗传 病等
基因突变的预防措施：通过改善 生活环境、健康饮食、适量运动 等预防基因突变
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基因突变的检测方法：通过基因 测序、基因芯片等技术进行检测
物降解等
基因突变与医学研究
基因突变与疾病：研究基因突变与疾病的关系，为疾病治疗提供新的思路和方法 基因治疗：利用基因突变技术，修复或替换病变基因，达到治疗疾病的目的 药物研发：通过研究基因突变，发现新的药物靶点，为药物研发提供新的方向 个性化医疗：根据患者的基因突变情况，制定个性化的治疗方案，提高治疗效果和患者的生活质量
转座子的插入突变及转座子的应用
下了一个双链缺口。
供体被释放
Tn 连接到靶上
图 23-43 Tn 的两条链先后被切割，然后转座子与切开 的靶位点连接。
（二）复制 型转座
特征：
1、转座后原 来位置上的 转座因子保 持不变；
2、转座过程 中有一共整 合体。
Tn 靶 单链交错切割
转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接 交叉结构(单链转移复合
2、构建突变体库
正因为以上转座子的特征，转座子才 被广泛应用于构建插入突变体库，现 已成为研究基因功能的重要手段之一。 目前研究和应用得较多的有Tn10、 Tn5、Tn3和Mu噬菌体 。
3、鉴别菌株及群体多样性
转座子通常限制性地分布于特定的真 菌菌株或群体中，可以作为特定菌株 的诊断工具，已用于丝状真菌群体多 样性分析。在医药工业方面已用于有 益菌株的鉴别， 在植物病理学方面已 用于鉴别特定的病原 。
转座子的插入突变及转座子 的应用
主讲人:杨长友 本组成员:杨菊 孙青芝 陈骊君 陆朝军 杨长友
内容提要
一、转座子的发现 二、转座子的分类 三、转座子的转座机制 四、转座子的遗传效应 五、转座子插入位点的鉴定方法 六、转座子的应用
一、转座子的发现
转座子（transponson,简称Tn）, 又称易 位子，是指存在于染色体DNA上可以自主 复制和位移的一段DNA序列。
从 3’ 末端复制 产生共合体
重组
共合体
四、转座的遗传学效应
❖ （1）插入突变失活或改变基因表达的 模式。
插入突变失活是转座的最直接效应，但 转座也可以通过干扰宿主基因与其调控元件 之间的关系或改变DNA的结构而影响基因的 表达。
四、转座的遗传学效应
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
基因敲除的原理
《基因敲除的原理》基因敲除可以说是基因组学、细胞分离培养以及转基因技术的组合。
那么基因敲除的原理是什么呢？基因敲除的方法有哪些呢？在此，做个小结，以供大家学习。
一.概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法：1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，**证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson**建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中*普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，*常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
基因敲除技术在疫苗研究中的应用考核试卷
四、判断题（本题共10小题，每题1分，共10分，正确的请在答题括号中画√，错误的画×）
1. 基因敲除技术可以用于所有类型的疫苗研究。（ ）
2. CRISPR/Cas9基因编辑系统中的Cas9蛋白可以直接识别并结合到目标DNA上。（ ）
D. 所有以上选项
13. 基因敲除疫苗研究可能涉及的实验步骤包括以下哪些？（ ）
A. 目标基因的识别
B. 基因敲除载体的构建
C. 细胞转染
D. 免疫学评估
14. 以下哪些是基因敲除疫苗研发中需要考虑的伦理问题？（ ）
A. 对基因的改变可能影响生态系统
B. 基因敲除可能导致的长期影响
C. 对人类胚胎的基因编辑
2. 分析基因敲除疫苗相比传统疫苗的优势和可能存在的问题，并讨论如何解决这些问题。
3. 以一种病毒为例，阐述如何利用基因敲除技术制备针对该病毒的疫苗，包括目标基因的选取、基因敲除策略的设计以及疫苗效果的评价方法。
4. 讨论在基因敲除疫苗研究中，伦理问题的重要性，以及如何平衡疫苗研究的科学进展与伦理考量。
D. 病毒变异
6. 以下哪些方法可以用于评估基因敲除疫苗的免疫效果？（ ）
A. ELISA
B. 流式细胞术
C. 免疫组化
D. 体内实验
7. 以下哪些生物体被用于基因敲除疫苗的研究和开发？（ ）
A. 细菌
B. 昆虫细胞
C. 动物细胞
D. 植物细胞
8. 基因敲除疫苗在临床前测试阶段需要考虑以下哪些因素？（ ）
A. 同源重组
B. CRISPR/Cas9
C. RNA干扰
D. 聚合酶链反应
2. 以下哪种方法不是基因敲除技术的应用？（ ）
转座子应用的研究进展
结论
转座子的应用研究在过去几十年中取得了显著的进展，从基础研究到应用研究 展现出广阔的前景。然而，尽管转座子的应用具有巨大的潜力，但其在实际应 用中仍存在一定的局限性和挑战。例如，对于人类和其他高等生物而言，转座 子的活性受到严格的限制，这限制了其在基因治疗和作物改良等方面的应用。 此外，虽然基因组编辑技术为转座子的应用提供了更为精准的手段，但其仍然 存在脱靶效应等潜在风险。
3、工业领域
在工业领域，转座子的应用主要涉及微生物发酵和生物催化等方面。通过利用 转座子改变微生物的遗传特性，可以优化发酵和催化过程，提高产品的产率和 纯度。例如，利用转座子改良酵母菌株的代谢途径，可以提高乙醇等产品的生 产效率。
研究方法
转座子应用的研究方法主要包括传统的基因功能研究方法和现代的基因组编辑 技术。
转座子应用的研究进展
目录
01 转座子的基本特征和 分类
02 研究现状
03 应用前景
04 研究方法
05 结论
06 未来研究方向
转座子（Transposons）是生物界中一类重要的基因元件，它们能在染色体内 部移动，从而改变基因组的构象和功能。近年来，随着转座子研究的深入，人 们发现转座子不仅在基因组进化中发挥重要作用，而且在基因治疗、基因编辑 和生物进化等领域具有广泛的应用价值。本次演示将重点探讨转座子应用的研 究进展及其在未来研究中的潜在价值。
1、传统研究方法
传统的基因功能研究方法主要包括基因敲除、基因互补和基因过量表达等。这 些方法通过改变目标基因的表达水平或敲除关键基因来研究基因的功能和作用 机制。例如，利用同源重组技术将转座子插入到目标基因组位点，从而研究该 位点对基因表达和细胞生物学特性的影响。
2、基因组编辑技术
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• （3 ）当一个基因家族的多个成员沿染色体串连排列时，可采用复
制型的转座系统创建该基因家族全部成员均被敲除的突变体。
• 随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多 不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终 存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因 并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括： • 一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一 个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别 的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同 样的功能； • 另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成 细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行 相应的研究了
特点：
• 1、所有生物的染色体都有转座子 • 2、转座相关序列可以占据物种基因的很大 一部分，如人和玉米基因组的50%以上是由 转座相关序列组成 • 3、转座子的含量在不同基因组中变化很大 • 4、当转座子移位时，转座因子通常对插入 位点几乎没有序列选择性
转座子类型：
• 1、DNA转座子
• 2、类病毒反转录转座子
• 睡美人转座子(sleeping bueaty,转座子SB)已证明在小鼠和人细胞中
可以激活,转座子插入新的位点后，该位点附近的基因即受到抑制
呈现隐性的“睡美人”表型。 • 一旦转座子在转座酶的作用下从这一位点上转走，该位点的基因 隐性表型又恢复为显性表型，即“睡美人苏醒”。调控转座酶和 转座子活性的系统称为青蛙王子(Frog Prince)。 • 用特异的开放阅读框捕获技术，可以使自然散在的转座酶编码基 因高表达，人为催化激活转座子使其苏醒，执行插入、切除等任
•转座子(transposon)是存在于DNA上可自 主复制和移位的基本单位。 •由Barbara McClintock 在20世纪40年代首 次从玉米中发现，从此改变了人们对基因 组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在 染色体上呈线性固定排的传统理论。 •1983年McClintock因发现转座子被授予诺 贝尔奖
务。目前已经应用于微生物、昆虫、植物、动物及人类基因组功
能的研究。例如蛙类基因组含有Tcl水手转座子超家族，呈自然失 激活转座子，使睡美人转座子苏醒。
活状态，转座酶与转座增强子序列末端结合,在HMGBI蛋白协助下，
使用转座子进行插入突变的优点有：
• （1 ）转座子能够在转座酶的存在下从插入位点剪切下来，造成突
变体反转。采用这种方法可进一步确证突变体表型是否由转座子 插入突变引起。 • （2）大多数转座的位点偏好于连锁位点，所以如果有一个可转座 的元件靠近目的基因，那么可转座的元件即会高效地移动并插入 目的基因。因此，即使在突变体库中没有发现期望的插入位点， 仍可以采用转座子在连锁位点上的转座获得目的基因被插入失活 的品系。
• 3、聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子
转座机制：
• 1、剪切-粘贴机制
ห้องสมุดไป่ตู้
• 2、复制-粘贴机制
插入突变
• 转座子插入突变是利用转座子在染色体上可移 动的特点，当其跳跃插入到某个功能基因内部 或邻近位点时时，就会引起该基因的失活，并 诱导产生突变型。
• 因此我们可以利用某些能随机插入基因序列的 转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突 变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然 后通过相应的标记（如Tn5转座子含kan抗性基 因）进行筛选获得相应的基因敲除细胞。