实验二、转座子随机突变及目标表型的筛选
随机突变文库构建与筛选研究进展
随机突变文库构建与筛选研究进展随机突变文库的构建是通过对目标基因或蛋白质进行随机突变，从而产生一个具有广泛多样性的突变体文库。
该文库可用于进一步筛选和研究目标基因或蛋白质的功能和特性。
化学诱变法：通过化学诱变剂处理DNA，使其发生随机突变。
转座子法：利用转座子在基因组中插入、删除或替换序列，从而产生随机突变。
同源重组法：利用同源重组原理，将外源基因随机插入细胞基因组中，从而产生随机突变。
高通量测序法：通过对大量基因组进行测序，发现基因中的随机突变，从而构建突变文库。
筛选是通过对随机突变文库中的突变体进行筛选，找出影响目标基因或蛋白质功能的关键突变体，从而研究其功能和特性。
含量测定法：通过检测突变体中目标蛋白质的含量，筛选出具有高表达量的突变体。
活细胞筛选法：通过对细胞生长、存活和代谢等指标进行检测，筛选出具有特定生物学表型的突变体。
测序法：通过对突变体进行测序，找出影响目标基因或蛋白质功能的关键突变序列。
功能筛选法：根据实验设计要求，通过特定筛选方法检测突变体的生物学功能，从而确定影响目标基因或蛋白质功能的关键突变体。
例如，利用双荧光杂交实验检测细胞因子的活性、利用表型筛选法检测抗药性突变等。
近年来，随着分子生物学和基因组学的快速发展，随机突变文库的构建和筛选已成为研究基因和蛋白质功能的重要工具。
尤其是以高通量测序技术为代表的技术手段，使得研究人员能够在短时间内对大量基因组进行测序和分析，快速发现基因中的随机突变。
新的筛选方法和技术也不断涌现，为随机突变文库的筛选提供了更多选择和可能性。
随机突变文库的构建和筛选是研究基因和蛋白质功能的重要工具。
随着技术的不断更新和发展，该领域的研究也将不断取得新的进展。
未来，随着更多技术和方法的涌现，相信研究人员将能够更加深入地了解基因和蛋白质的功能和特性，为解决人类面临的生物学问题提供更多思路和方法。
金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，具有较强的抗药性和适应能力。
转座子的研究进展
转座子及其相关技术的研究摘要：转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列，转录组的活动对生物体基因组的转录以及演变存在着严重影响，本文就转座子的基因机理及特征、转座子沉默、转座子的标签技术以及其在植物中的运用进行阐述。
转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。
MclCintockl’嗜次在玉米中的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。
目前认为，多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现的原因源于转座子的可动性，并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化，转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。
1.转座子特征与分类基因转座时发生的插入作用中受体分子都有一段3-12bp的靶序列DNA会自我复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。
转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子。
第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段,重新插入基因组DNA中。
第二类转座子又称为返座元，在结构和复制上与反转录病毒类似，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。
2转座子相关技术2.1转座子分离方法有4种方法用来分离转座子:(l)转座子诱捕法，此法适用于分离具有相当高的整合和切割频率的转座子。
(2)Southern杂交法，此种方法需要有适当的探针，用于检测已知的转座子。
(3)重复DNA序列鉴定法，适用于高拷贝数的无论是否有活性的转座子。
(4)PcR扩增法，对己知序列的转座子可以设计引物直接PCR扩增。
2.2转座子标签技术转座子标签技术是根据转座子随机插入引起突变的特性而发展起来的分离未知基因的方法。
转座子整合进入启动子或编码区，使基因突变失活并产生一种新的表型，再根据转座子上设计的已知序列标签克隆失活的基因，分离转座子和突变基因的侧翼区鉴定该基因，是定向研究基因的有效方法。
mu转座子介导的株高突变优势筛选
河北农业大学本科毕业论文(设计) 题目： Mu转座子介导的株高突变优势筛选学院：农学院专业班级：植物科学与技术0802学号：2008014040202学生姓名：田鹏浩指导教师姓名：陶勇生指导教师职称：副教授二O一二年6月6日Mu转座子介导的株高突变优势筛选田鹏浩(河北农业大学，保定 071000)摘要：【目的】Mutator（Mu）转座子是玉米基因组内产生诱变的内源转座因子，其在基因组内的拷贝数和诱变效率远远优于其它转座子。
利用Mu转座子介导的玉米株高性状的突变体来研究其遗传特性。
通过计算后代株高的分离情况，来验证株高的突变是否与插入有关，以及扩增Mu因子插入位点的侧翼序列，为找到影响株高的基因奠定基础，从而扩展株高突变的分子遗传学研究。
此外，还为高产玉米育种提供了种质资源和理论指导。
【方法】使用原始Mu群体（uniformMu）与玉米优良自交系综31杂交获得M1代，对其自交后代的M5群体的植株表型进行逐株全生育期的田间调查，根据极端性状的遗传分析和数量性状的统计分析筛选和鉴定Mu转座因子插入诱变的突变群体。
【结果】研究结果表明，筛选了M5群体的的75个家系共543株，11BD753、613、728、1748、1779家系出现株高性状的分离，极有可能是Mu插入引起的，其中，11BD753、1779为矮化突变，11BD613、728、1748为高杆突变。
【结论】目前经过分析的这几个家系的胚大小性状出现了显著分离，需要进一步对其研究，尤其是要找出Mu插入位点的侧翼序列，再经行基因功能和遗传方面的研究。
关键词：玉米；Mutator转座子；株高突变；突变分析Screening Mutator–mediated Plant Height mutation advantageAbstract: 【Objective】Mutator (Mu) transposons is endogenous transposons producing mutation groups, i n maize genomic .It’s copies and mutation frequency are superior to other transposons. By Mutator–mediated maize plant height to study their genetic characteristics. By calculating the separation of mutation plant height, to verify whether the plant height is related with the insertion of Mutator, and find Mutator flanking sequences, then to lay foundations for finding genes that affect the height of the plant. Moreover, to extend the molecular genetic studies of plant height mutation development, in addition ,to provide germplasm resources and theoretical guidance for breeding high yeild maize. 【Method】Using uniformMu and elite inbred line Z31 crossing got M1and to it’s Self-crossed Progeny M4 do the field survey of the plant phenotype during the whole growth stage, and screening and identifying Mutator–mediated inspectional mutations basis on genetic analysis of the extreme characters and statistical analysis of the quantitative characters. 【Result】The study results show that the plant height mutation, from M5group’s 75 families, total over 543plant ,11BD753,613,728,1748,1779 family lines appear separation of plant height, most likely caused by Mu insertion, and 11BD753,1779 family lines appear dwarf mutation,11BD613,728,1748 family lines appear high pole mutation.【Conclusion】At present there are remarkable separation of this lines after the analysis the character of these maize embryo size, needing more further research on this lines, particularly needing discover the flanking sequence of the Mu insertion and develop aspect research on gene function and the heredity character .Key words: Maize mays L.; Mu transposons; Plant height mutation; Analysis of mutation1.前言玉米是当今世界最重要的粮食、饲料、和工业原料作物，是全世界最广泛种植的农作物。
转化子筛选方法
转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。
然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。
根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。
此法又称蓝白筛选法。
二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。
将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。
因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。
2。
斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。
2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。
3。
Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。
可移动的遗传因子(转座子)最新实用版
5、转座子作为研究工具：
主要用于如下研究： ① 基因传送载体 ② 结构重组 ③ 基因表达 ④ 基因突变 ⑤ 克隆 ⑥ 基因作图
四、原核生物和真核生物的转座子
（一）原核生物的转座子
1、插入序列（IS）与Ⅰ类复合转座子
插入序列是最简单的转座子。包括：
① 二个分离的反向重复序列（ITR） ② 一个转座酶（transposase)编码基因
（二）R 质粒——耐药性质粒
➢ R 质粒由抗性转移因子（RTF）和决定抗性 因子（r-决定子）两部分DNA片段组成。
➢ R 质粒含有对抗生素的抗性基因，使宿主细 菌产生对抗生素的抗性，这种耐药性是可以 遗传的。
（三）Col 质粒——大肠杆菌质粒
➢ 是能产生大肠杆菌素的大肠杆菌质粒，可以 抑制或杀死不含Col 质粒的亲缘细菌。
两端有反向重复序列转座后靶位点是正向重复编码与转座有关的蛋白转座酶可以在基因组中移动复制型转座非复制型转座保守型转座一转座中复制子融合形成共和体cointegrate一个含有两个质粒的细胞质粒各有一个转座子两个质粒可以融合在一起形成共和体这一过程称复制子融合repliconfusion
第三章
可移动的遗传因子（转座子） 和染色体外遗传因子
IR
Transposase Gene
有用基因 IR
3、转座噬菌体
转座噬菌体是一种溶菌周期和溶源性交替 方式的噬菌体，可诱发大肠杆菌突变。
Mu噬菌体：
① 既有温和噬菌体的特性，又有转座子的特性。 ② 噬菌体DNA的多个拷贝转座到染色体DNA的许
多位点上，最终由这些染色体上的转座单位进行 噬菌体包装。 ③ Mu噬菌体基因组右末端，存在由3kb组成的G片 段，或称可倒位片段。G片段在不同的Mu噬菌 体DNA分子中取向不同。
转基因筛选实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除转基因筛选实验报告篇一：转基因小鼠鉴定实验转基因小鼠鉴定实验在刚出生产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。
因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。
1．转基因整合检测鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DnA，检测其基因型。
检测方法包括pcR和shouthern杂交。
（1）基因组DnA的提取：1）将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。
2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm 的鼠尾。
（2）pcR检测：转基因的初始筛选通常采用pcR检测技术。
该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。
由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。
因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DnA或其它标本的基因组DnA的污染。
假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。
pcR实验应采用双复管，甚至三复管。
阳性结果最好用southern杂交技术进一步证实。
（3）southernblot分析：该技术虽然没有pcR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。
southernblot的实验操作参见第一章的第八节。
2．转基因表达检测转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。
而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。
其检测包括RnA分析技术和蛋白质检测技术。
篇二：转基因技术综述动物转基因技术研究进展及其应用前景孙凤俊张佳谊韩广文（北京奶牛中心北京延庆102100）摘要：转基因技术作为生命科学的前沿技术之一，已经逐渐走入了人们的生活。
转基因技术可以认为是在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、植物朝着对人类有利方向发展的技术。
本文介绍了转基因技术及其应用研究现状，并预测了未来发展前景，阐述了该技术的利弊关系，指出只有通过正确的引导和规范管理，才能很好地利用该技术，使它为人类服务。
转座子(真核)概论
•反转录病毒基因组RNA的长度为5～8 kb。
•基因组RNA的中部带有gag，Pol与env 三个“基因”，“基因” 这一术语在这里表示为编码区，每一编码区通过加工实际上产 生出多种蛋白质。
•一个含3个基因的反转录病毒其基因的排列方式为gag-pol-env。 其中gal基因编码病毒粒子核心结构蛋白成份，包括核酸结合蛋 白；pol基因编码反转录酶、整合酶和蛋白酶；env基因编码病毒 外膜蛋白。
丝状真菌中的这些反转座子大多都属于gypsy组，具有pol和 gag两个阅读框架。
如尖孢镰刀菌中的Skippy，长度为7846 bp，末端有2个正 向重复的LTR (429 bp)，在靶位点产生5 bp的正向重复。中间 有2个ORF，第1个ORF的长度为2562 bp，与反转录病毒的 gag基因有同源性，第2个ORF的长度为3888 bp，与反转录病 毒pol基因编码的反转录酶、蛋白酶和RNase H有同源性，其 排列顺序与Gypsy组相同。其它一些真菌LTR-反转座子见表 4。
表4 一些真菌中的LTR-反转座子
LTR-反转座子 长度(bp) LTR 靶序列重复 拷贝数 寄主来源
Gypsy组： Foret ～8000 不详 不详 多拷贝 尖胞镰刀菌(F. oxysporum) Skippy 7846 429 5 多拷贝 尖胞镰刀菌(F. oxysporum) CfT-1 6968 427 5 25 黄枝胞菌(Cladosporium fulvum) Maggy 5638 253 ? 多拷贝 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) Boty ～6000 596 ? 多拷贝 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea) Afult1 6914 282 5 多拷贝 烟曲霉(Aspergillus fumigatus) Mars4 2
植物基因分离的图位克隆技术
植物基因分离的图位克隆技术毛健民 李俐俐(周口师范高等专科学院生物系河南周口466000) DN A是遗传的物质基础。
遗传的基本单元是以基因的形式包含在DN A序列内。
要想从分子基础上来理解遗传的本质,基因的分离是最基本的前提。
现在分离和克隆植物基因的方法很多,如传统的功能克隆及近年来发展十分迅速的表型克隆。
但大多数情况下,我们并不知道基因的表达产物,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,最常用的基因克隆技术有转座子示踪法、随机实变体筛选法和图位克隆法。
其中,转座子示踪法中的转座子受其种类、活性和数量的制约,随机突变体筛选法随机性较大且不能控制其失活基因的种类和数量,也限制了其应用。
比较而言,图位克隆技术随着相关配套技术的日渐成熟,已成为分离基因的常规方法,并在分离不同的植物发育基因中得到了广泛的应用。
本文对图位克隆技术的原理、基本技术环节及应用作一介绍。
1 图位克隆技术的原理图位克隆技术又称为定位克隆技术,是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的1种新的基因克隆技术。
它是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的1种方法,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DN A文库,从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。
2 图位克隆的技术环节2.1 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记 筛选与目的基因连锁的分子标记是图位克隆技术的关键,常用的分子标记有RF L P标记、R APD标记、微卫星标记和A FL P标记等。
现在已有几十种技术可用于分子标记的筛选,随着分子标记技术的发展,一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也为分子标记的筛选提供了有益的借鉴。
利用这些分子标记技术结合使用近等基因系(N ILs)或分离群体分组分析法(BSA)就可以快速地从数量繁多的分子标记中筛选出与目的基因紧密连锁的分子标记。
实验二、转座子随机突变及目标表型的筛选
挑单菌落分别接种于5ml MAZ培养基中30℃摇瓶培养（野生 菌对照）.
第四天：
第六天：
用比色法测定菌液中的IAA含量。 比色试剂：含12g/L FeCl3 的H2SO4 取1ml 测量OD600； Evaluation only. 取1ml 菌液12000rpm 离心 5min后取上清与比色试剂等量混 eated with Aspose.Slides for，然后测 .NET 3.5 Client Profile 5.2.0 合，摇匀后在暗处放置 30 min OD540nm
Email:myc0307@
实 验 内 容
♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列
Evaluation only. ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 eated with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0 ♣ 利用 SDS-PAGE 分析融合蛋白的可溶性 Copyright 2004-2011名称 氨苄青霉素 (Ap) 贮存液配制方法 100 mg/ml 水溶液，-20℃
使用浓度 E.coli A.brasilense
25 μg/ml
卡那霉素(Km)
100 mg/ml 水溶液，-20℃ 50 μg/ml Evaluation only.
30-50 μg/ml
萘啶酮酸 (Nx) 20 mg/ml 水溶液， ℃ 5 μg/ml 5.2.0 eated with Aspose.Slides for-20 .NET 3.5 Client Profile Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.
标准曲线
实验结果
表 巴西固氮螺菌 Yu62 野生型及突变体的IAA产量 菌株(Strains) (OD600) (OD540) IAA浓度 (μg/ml)
实验九利用不同的方法筛选转化子-09级
实验方法
转化方法
采用化学转化、电转化或 基因枪等方法将转化质粒 导入宿主细胞。
筛选方法
利用抗生素或选择剂对转 化子进行筛选，或者通过 荧光显微镜观察荧光蛋白 表达情况。
鉴定方法
采用PCR、测序或酶切等 方法对筛选得到的转化子 进行鉴定，确认目标基因 是否成功导入并表达。
实验步骤
1. 准备宿主细胞和转化质粒，将宿主 细胞培养至对数生长期。
结果讨论
方法比较
根据实验结果，对不同筛选方法 进行比较，分析各方法的优缺点
及适用范围。
结果解释
结合实验原理和相关理论，对实验 结果进行解释，探讨影响转化子筛 选的关键因素。
实验改进
针对实验过程中出现的问题和不足， 提出改进措施和建议，为后续研究 提供参考。
04
不同筛选方法的比较
方法一：基于表达量的筛选
实验展望
01
改进实验方法
在未来的实验中，我们可以进一步改进实验方法，如优化转化条件、提
高转化效率等，以获得更准确、更可靠的实验结果。
02 03
拓展研究领域
本次实验主要关注转化子的筛选和鉴定，未来可以进一步拓展研究领域， 如研究转化子的生物学特性、功能分析等，以更全面地了解转化子的性 质和作用。
加强合作交流
03
实验结果与分析
数据收集与整理
数据来源
从实验过程中记录的各项指标， 包括转化子的生长情况、表达产 物的量等。
数据整理
对收集到的数据进行分类、编码 和标准化处理，以便后续分析。
数据分析方法
描述性统计
相关性分析
对转化子的生长情况、表达产物的量 等指标进行描述性统计分析，包括均 值、标准差、最大值、最小值等。
导的玉米突变体库的构建及表型评价
2. 从 146 个突变体的自交果穗上随机选取子粒，按穗行种植，统计可以遗传的 突变家系和回复突变频率，结果表明可遗传的突变家系有 129 个家系，遗传的性状有 以下 7 种表型变异：叶片红色条纹、叶片白色条纹、叶片黄色条纹、叶片裂生、叶片 卷生、叶脉红色和叶片皱缩，回复突变频率为 11.64%。
随机选取 M2 单株进行自交，得到 M3 果穗 3256 个，并统计果穗表型突变，突变 频率为 0.37%，M3 果穗花斑子粒数目占子粒数目的比例约为 4.7%。表现突变性状的 单株自交保种。
学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址：
电话： 邮编：
Mutator 转座子介导的玉米插入突变体库的构建及表型评价
1 引言
玉米(Zea mays L.)是当今世界最重要的粮食作物之一，也是重要的饲料和工业原 料作物，随着全球经济发展，对玉米的需求量持续增长，玉米在我国国民经济发展中 占有十分重要的地位。除了具有较高的经济意义，玉米也是很好的遗传研究材料。1947 年，McClintock在玉米中首先发现了一些具有转座能力的因子，能导致玉米基因组重 拍，把这种具有转座能力的因子叫做转座子[1]。转座子作为一种获得插入诱变的遗传 突变体和分离基因、研究功能的有效工具, 越来越受到广泛重视。
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
实验名称：利用不同的方法筛选和鉴定转化子院系：专业：生物工程班级：08生物工程二班姓名：学号：0820020005同组人员：利用不同的方法筛选和鉴定转化子综合实验报告摘要本文通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验方法，通过α-互补筛选（蓝白斑）从转化子中筛选重组子，由于p MD-19 T Vector 上带有lacZ基因，因此可以通过α-互补筛选出重组子，重组质粒的转化子在生色诱导培养基上形成白色菌落。
菌落直接PCR的分子鉴定，可以鉴定细菌中有没有转入外源DNA；然后再挑取单菌落进行培养、提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小；最后用限制性内切酶切割大小符合的质粒，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。
关键词蓝白斑菌落直接PCR 提质粒酶切鉴定前言因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上。
实验七准备了重组载体质粒DNA为p MD-19 T Vector与PCR的连接产物，p MD-19 T Vector上带有Amp r ，故筛选转化子采用Amp抗性筛选。
通过α-互补筛选（蓝白斑）从转化子中筛选重组子，由于p MD-19 T Vector 上带有lacZ基因，因此可以通过α-互补筛选出重组子。
β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。
这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。
由α-互补产生的lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在下被IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落，当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
菌落直接PCR的分子鉴定，PCR技术是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA的某个特殊区域扩增出来的技术。
转座子插入突变和转座子实际应用
4、生态环境污染的生物修复
由于基因的可变性及转座子的遗传调 控， 许多微生物能够利用人工合成的 化学物质，与微生物分解代谢相关的 基因往往与插入元件相连。当环境污 染时，转座子转移频率提高，增加了 微生物种群的生物降解潜力。
5、转基因生物的克隆
在细胞工程中，转座子可作为有力的工具 和基因载体系统用于克隆转基因生物。基 因组插入质粒P因子已成功克隆转基因果蝇。 通常认为，转座子的插入能引起新的突变 体形成，但其副作用也许会抵消由转基因 提供的任何优势，以可移动DNA片段作为 载体尚存在转移基因结果的不稳定现象和 内源跳跃基因的相互影响。因此，这方面 的应用还处于探索阶段。
反向PCR法
• 该方法的操作步骤为，提取转座子插 入形成的突变体的染色体，用适宜的 限制性内切酶消化后，用连接酶进行 酶切片段的分子内自连，然后用一对 位于转座子上的外向型引物进行PCR 扩增， PCR产物直接测序或克隆在T 载体上测序， 获取转座子插入位点周 围序列的信息。
六、转座子的应用
❖ 基因的标定
交叉结构(单链转移复合
图 23－41 转座模型。Mu 转座产生交换结构，此结构通过复制产生共合体， 共合体中的转座子之间发生交换产生 2 个重组子。
四、转座的遗传学效应
❖ （1）插入突变失活或改变基因表达的 模式。
插入突变失活是转座的最直接效应，但 转座也可以通过干扰宿主基因与其调控元件 之间的关系或改变DNA的结构而影响基因的 表达。
转座子插入突变和转座子实 际应用
内容提要
一、转座子的发现 二、转座子的分类 三、转座子的转座机制 四、转座子的遗传效应 五、转座子插入位点的鉴定方法 六、转座子的应用
一、转座子的发现
转座子（transponson,简称Tn）, 又称易 位子，是指存在于染色体DNA上可以自主 复制和位移的一段DNA序列。
突变体筛选课件
对离体培养物的筛选
ﻍ直接筛选法 ①正选择法(主要对抗性突变体的筛选) ②负选择法(主要对营养缺陷型或者温
度敏感型突变体的筛选) ﻍ间接筛选法
直接筛选法
ﻍ耐低温突变体的筛选主要是以悬浮细胞培养为实 验材料，在0℃-2℃条件下培养,然后从存活的细 胞系中进行耐低温突变体选筛。 Handa等用聚乙二 醇为选择剂，选出了具耐寒特性的番茄细胞系， 但经继代培养后，细胞的耐旱特性逐渐丧失了。
绿岛法
ﻍ也称为“原位筛选” ﻍ许多重要基因在培养细胞处于无组织、无
器官的未分化状态并不表达，无法通过表 型进行筛选 ﻍ适用于抗除草剂和抗病毒突变体的筛选 ﻍ一般选用单倍体植株
一般选用单倍体植株,用500拉德的γ射 线照射后喷洒除草剂或接种病毒。敏感细 胞受害坏死,抗性突变细胞保持原色,在受 害细胞间形成绿岛,取下绿色组织灭茵后进 行培养,并诱导其形成愈伤组织和再生植株, 然后用秋水仙素处理,使其成为二倍体,就 可获得具抗性的突变体。
ﻍ多布筛选法：先加入低剂量的选择剂，是 一部分细胞不能正常生长，再逐步加大剂 量，进行多布筛选，得到耐受最高选择的 突变细胞团。 【对多基因控制的抗性筛选 】
负选择法
ﻍ使用特定培养基 ﻍ让突变体细胞受到抑制不分裂呈休眠状态
而正常细胞正常生长 ﻍ用一种对休眠态突变细胞无害而能毒害正
ﻍ首先确定选择方向 ﻍ可采用化学物质(如高浓度盐类、碱类、
除草剂、抗生素、真菌毒素、重金属和特 定代谢物等)和物理条件(低温、高温等) 处理 ﻍ筛去正常细胞，获得抗性愈伤组织或抗性 细胞系 ﻍ再生获得抗性突变体植株
实验三、 大肠杆菌半乳糖苷酶诱导表达
2. 培养基及试剂
(1). 基本培养基(M9培养基) KH2PO4 30g； Na2HPO4 60g；NaCl 5g； NH4Cl 10g。 溶解后加水至1L，121℃灭菌20min。 灭菌后，在100 ml M9中加入： 0.1 mol/L MgSO4 10ml, 0.01 mol/L CaCl2 10 ml, 加无菌水至1L，作为基本培养基。
现代微生物学实验技术
马玉超
北京林业大学生物科学与技术学院
办公地点：生物楼117；电话：62336016； Email:myc0307@
实 验 内 容
♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列
♣ 转座子随机突变及目的表型的筛选
♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
酶比活力 U/ml OD600
1 2 3 4 5
●下次实验
♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性
♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
第一组：乳糖对β-半乳糖苷酶的诱导
(1). 往25 ml 基本培养基的三角瓶中加 1 ml 10%的甘油； (2). 接种25 ml 生长在甘油培养基18h的菌液，计时，
并取1ml测OD600；
(3). 30℃ 水浴摇床振荡培养1 h，取 1 ml并测OD600值。 然后向培养基瓶中加 1ml 10%的乳糖，摇匀并开始 计时。立即取出500μl培养液到含有SDS和氯仿的小 离心管中，至于冰浴中，此管为0min样品。培养瓶 继续在30℃水浴摇床振荡培养；
(1). 将上述含样品的小离心管从冰浴中取出，置于 30℃水浴中平衡10 min；
(2).在每个小离心管中分别加入500μl Z缓冲液和 200μl底物ONPG(4mg/ml)，反应一直到黄颜色 出现，加入500 μl 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应 （计时）
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
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实验原理
Tn5：发现于E.coli，序列全长5818bp。 核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)； 两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白
(Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一 个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱基不相同，是转座 酶(Tnp)的作用位点。
现代微生物学实验技术
马玉超
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办公地点：生物楼117；电话：62336016； Email:myc0307@
实 验 内 容
♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列
♣ 转座子随机突变及目的表型的筛选
♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导
♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性
实验结果
表 巴西固氮螺菌 Yu62 野生型及突变体的IAA产量 菌株(Strains) (OD600) (OD540) IAA浓度 (μg/ml)
ck(培养基) Sp7 1-1 1-2 1-3 1-4
●下次实验
大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导
实验材料
1. 菌株
E. coli S17-1/pPRL1063a; 巴西固氮螺菌sp7
2. 培养基及试剂
(1). 细菌丰富培养基
LB培养基 LD培养基
胰蛋白胨 (g) 10 10 酵母提取物 (g) 5 5 氯化钠 (g) 10 2.5 pH 7.0 6.8 固体培养基加入1.3% 琼脂粉，dH2O定容至1L，121℃灭菌20min
♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
转座子随机突变及目的表型的筛选 李丽萍
实验目的
1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理 2. 学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程 3. 掌握双亲接合实验的原理及过程
实验原理
转座子：
转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分 跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。
注意：事先准备好LD平板
第三天：
用液体LD培养基洗下菌泥，铺于同时含有Km、Ap、Nx的LD 平板上，30℃培养，筛选接合子。
第四天：
挑取接合子在含有上述三种抗生素的LD培养基平板上划线分 离，保证得到的为单菌落。
第五天：
挑单菌落分别接种于5ml MAZ培养基中30℃摇瓶培养（野生 菌对照）.
第六天：
(2).用于IAA摇瓶培养的培养基(MAZ培养基)
(3).抗生素
抗生素名称 氨苄青霉素 (Ap) 卡那霉素(Km) 萘啶酮酸(Nx) 贮存液配制方法 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 20 mg/ml 水溶液，-20℃ 50 μg/ml 使用浓度 E.coli A.brasilense 25 μg/ml 30-50 μg/ml 5 μg/ml
用比色法测定菌液中的IAA含量。 比色试剂：含12g/L FeCl3 的H2SO4 取1ml 测量OD600； 取1ml 菌液12000rpm 离心 5min后取上清与比色试剂等量混 合，摇匀后在暗处放置30 min，然后测OD540nm
注意安全
注：空白对照，未接菌的培养基与比色用试剂的混合液。
标准曲线
转座子的发现：
20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学 家McClintock 通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研 究而发现转座现象，首次发现了能在基因组内不同 区域转移的控制成分。
实验原理
细菌转座子的类型：
插入序列 (Insertion sequence); 复合转座子 (Composite transposons); TnA 转座子家族 (TnA family); 可移动噬菌体 (Mu phage).
突变位点(Mutation site)
OE IS50L
P3 P4
IE kanr strr bleor
IE IS50R
OE
P1 (Tnp) P2 (Inh)
Tn5的转座机理
实验原理
实验原理
DNA sequencing
实验原理
非转移性质粒： 转移性质粒：能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能 带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移; 接合作用：质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接 接触才能进行.
3. 主要仪器
小型离ห้องสมุดไป่ตู้机
实验步骤
第一天：
中午12：30～13：30接种sp7 至5ml LD 液体培养基中，30℃ 振荡培养约20小时。 晚5：30，接种供体菌pRL1063a/E.coil S17-1 至5ml LB+Km 液体培养基中，37℃振荡培养约16小时。 第二天：
上午9：00，用同一个1.5 ml 离心管收集适量供体菌和受体菌。 12000rpm 离心30 sec，弃上清，用移液器将菌泥悬浮混匀后 移入LD平板中央，尽量减少气泡的产生。 30℃正置培养过夜。
受体菌，Ap Nx 巴西固氮螺菌Sp7 重组巴西固氮螺菌， Ap Nx Km
供体菌 S17-1 质粒pRL1063a,Km
实验原理
植物生长激素， 由植物根系细菌合成， 对植物的生长及一些 发育阶段的调控起关 键作用
A-B：吲哚乙酰胺途径； E-F-D：吲哚丙酮酸途径； C-D：色氨酸侧链途径
细菌中IAA合成的几种途径