Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV的复制

文章编号:042727104(2008)0320301205

收稿日期:2007207213

作者简介:尹　隽(1969—),女,讲师;通讯联系人钟　江,男,教授,E 2mail:jzhong@.

Tn5转座子插入p95基因不影响

AcMNPV 的复制

尹　隽,胡志鹏,宋大新,钟　江

(复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系,上海200433)

摘　要:从Tn5转座子介导的AcMNPV 随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP 2P95in.PCR 确认p95基因中插入了Tn5转座子;Westernblot 也证实A 2cApra41和AcGFP 2P95in 感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95ku 变为55ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的.

关键词:杆状病毒;突变体;复制;基因表达

中图分类号:Q812 文献标识码:A

杆状病毒(Baculoviridae )是一类主要感染节肢动物的病毒,基因组为双链环状DNA,大小约为80～180kb [1].一方面它们作为基因表达载体已被广泛地用于生产各种蛋白质,另一方面它们也可以作为生物杀虫剂使用.在所有的杆状病毒中,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Auto gra pha cali fornica multiplenucle 2opolyhedrovirus,AcMNPV )是被研究得最为深入的一种病毒,该种病毒的基因组大小为133894b p,包括156个潜在的阅读框[2].尽管有一些基因已经被研究得很清楚,比如病毒的结构蛋白,必需的顺式作用因子等[327],但还是有许多基因的功能尚不清楚.为了能高效地研究这些未知基因,我们用Tn5转座子介导的随机插入突变法构建了AcMNPV 突变库(李惠等[8],尹隽等,待发表).

本文研究了从突变体库中筛选到的一株p95基因带有插入突变的突变体.研究结果提示完整的P95蛋白对病毒在细胞中的复制是非必须的.

1　材料和方法

1.1　细胞、病毒和菌株

草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞用TNM 2FH 培养基(Sigma 2Aldrich,MO,USA

)补充10%的小牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL 链霉素培养.带有AcMNPV 基因组的质粒(bacmid )来源于Bac 2to 2Bac 系统(Invitro gen,CA,USA ),保存于大肠杆菌中,它转染Sf9细胞后可以复制产生感染性的AcMNPV [9].以在病毒多角体启动子下游插入绿色荧光蛋白基因(gfp )的bacmid (bacGFP )作为起始病毒基因组,利用体外转座系统构建了AcMNPV 随机插入突变体库(尹隽,发表中). E.coli BJ5183(RecA +)作为重组用菌

株,E.coli EC100(Epicentre,WI,USA

)用于保存bacmid.用于培养含bacmid 菌株的抗生素浓度分别为:卡那霉素(Kan )50m g/mL,庆大霉素(Gen )7m g/mL,阿普拉霉素(Apra )20m g/mL.

1.2　Tn5转座子插入定位

参见李惠等[8],简单介绍如下.根据AcMNPV 基因组序列,全基因组每隔1.5kb 沿同一方向设计了88个引物(分别命名为v1～v88,具体序列略).在转座子上设计两个引物Tn 2u p (5′2GTCTCCGACCT 2

第47卷　第3期

2008年6月复旦学报(自然科学版)JournalofFudanUniversit y (NaturalScience )Vol.47No.3Jun.2008

GATG 2CAGCTC 23′)和Tn 2down (5′2ACGACTACGCACTAGCCAACA 23′

)(图1).用v1～v88分别和Tn 2up,Tn 2down 组对作为引物,以突变体bacmidDNA 作为模板进行PCR 扩增,结果v45和Tn 2down 得到阳性PCR 产物.产物割胶回收后进行DNA 序列分析(上海英俊生物技术公司),得到转座子插入位置的上游一侧的序列.在距离上游插入位点约500b p 处再设计一个引物p95down (5′2CGGCGTCGGTCGTTTGAA 23′

),以p95down 和Tn 2up 作为引物再进行PCR,得到的产物同样测序,得到转座子插入位置下游一侧的序列(图1)

.

图1　转座子插入位置及引物示意图

Fig.1　Diagramofthelocusoftrans posoninsertionandsitesof primers

Orf 81,Ac 2TLP ,p 95:AcMNPV 编码基因;hr3:AcMNPV 基因组同源序列3,Tn5:Tn5

转座子;A pra :阿普拉霉素基因;v45,p95up,p95down,Tn 2up,Tn 2down:实验中所用

引物的位置和方向.数字代表在AcMNPV 上的相对位置

1.3　定向重组构建bacGFP 2P95in 重组病毒

在距离p95down 上游1kb 处设计引物p95up (5′2CTGATAACGTGCATCAACCG 23′

)(图1),以bacmidDNA 为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增,得到2.6kb 的片段,包括1.6kb 转座子序列和位于转座子序列两侧各0.5kb 的基因组序列.将该片段转化带有bacGFP 的大肠杆菌BJ5183菌株(BJ51832bacGFP ),让片段与bacGFP 发生同源重组.由于片段中的转座子序列含有Apra 抗性基因及启动子,用Kan/Gen/A pra 抗性平板筛选得到的就是同源重组后的bacmid 重组子.抽提重组bacmidDNA,以之为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR,并对扩增产物进行电泳检测.如果能得到2.6kb 产物,即为转座子插入p95基因的正确克隆.取同源重组bacmidDNA 电转化 E.coli EC100感受态细胞,得到的同源重组bacmid 命名为bacGFP 2P95in.抽提bacGFP 2P95inDNA,用Cellfectin (Invitro gen )转染Sf9细胞,得到重组病毒AcGFP 2P95in.同样以bacGFP 转染Sf9细胞,得到对照病毒AcGFP.

1.4　重组病毒AcGFP 2P95in 的鉴定

为了确定重组病毒的正确性,分别用AcGFP 和AcGFP 2P95in 病毒感染Sf9细胞(感染复数MOI=5

pfu/cell ),3d 后收取上清,分别抽取病毒基因组DNA.500μ

L 抽提液(20%PEG80001.6mol/LNaCl )与500μL 病毒上清混合,室温放置30min 后,15000r/min 离心15min.沉淀用20μLddH 2O 溶解后,加入

80μL 裂解液(10mmol/LTris

pH8.0,10mmol/LEDTA,20m g/mLRNaseA,0.25%SDS,80μg 蛋白酶K ).50℃反应1h 后,用等体积酚抽提.水相加入1/10体积3mol/LNaAc 及2倍体积的无水乙醇沉淀,即得到子代病毒的基因组DNA.以此为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增:94℃30s,58℃30s,72℃150s,共30个循环.

1.5　Westernblot 检测P95蛋白在Sf9细胞中的表达

24孔板中每孔接种大约2×105个细胞,同时加入适量病毒液使MOI 约为5pfu/cell.27℃培养72h 后,将贴壁细胞吹打下来,5000r/min 离心5min,沉淀用1×PBS 漂洗后,加入40μL2×SDS 样品缓冲液,进行SDS 2PAGE (10%)电泳分析和Westernblot 检测.一抗为用原核pET 系统表达的P95蛋白自制的鼠抗P95抗体(稀释倍数为1∶500),二抗为碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG 抗体(Sigma 公司,稀释比例为1∶30000).以BCIP/NBT 为底物,进行显色反应.

203 复旦学报(自然科学版)第47卷