现代生物技术重点整理--最终版本

现代生物技术的组成：

生物技术、基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程、分子进化工程、酶的定向进化、生物工程下游技术

生物技术：是利用生物体系，应用先进的生物学和工程学技术，加工或不加工底物原料，以提供所需的各种产品，或达到某种目的的一门新型跨学科技术

基因工程：用人工的方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，通过载体将目标基因导入到宿主细胞或个体，从而改变宿主遗传特性或获得基因表达产物的技术

细胞工程：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养，繁殖，或按人们的需求设计改变细胞的某些生物学特征，从而获得某些有用的物质，或改良生物品种和创造新品的技术

发酵工程：利用生物细胞的某种特性，通过现代化工程技术手段进行工业规模化生产人类所需产品的技术

蛋白质工程：是以蛋白质结构，功能研究为基础，运用生物化学，分子生物学，遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成编码蛋白质的基因入手，定向的改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构性质和功能，能更好的为人类服务的一种生物技术

分子进化工程：是在试管或实验室中模拟生物分子的进化，使长期的自然进化在实验中短期能实现

酶的定向进化：是在试管中模拟自然进化过程的人工进化策略，利用酶基因的突变或同类酶基因片段的重组，构建某个酶的随机基因突变库，通过基因操作的方法使这些基因在微生物在表达，人工控制条件筛选出人们所需的酶生物工程下游技术：指从基因工程中获得的动，植物和微生物的有机体或器官上，从细胞工程，发酵工程和酶工程产物中把目标化合物分离纯化出来，使之达到商业应用的目的的过程

酶工程:是利用酶，细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或通过对酶的分子结构修饰或改造以改善酶的特性，借助于生物反应器和工艺优化，有效的发挥酶的催化特性生产人类所需产品的技术

①获得目的基因②将目的基因与载体连接形成重组DNA

③将重组DNA导入受体细胞④筛选出能表达目的基因的受体细胞

基因工程的工具酶：

基因工程操作中，作为工具对基因进行切割和拼接等操作的酶，到目前为止，常用工具酶共300多种工具酶的分类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、碱性磷酸酶、逆转录酶

限制性内切酶：内切核酸酶中能够识别ＤＮＡ分子上某些特定的核苷酸序列并且将其切开的酶，称为限制性内切酶有三种：Ⅰ型限制性内切酶Ⅱ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶

I型限制性内切酶：是多聚体蛋白，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在

II型限制性内切酶：是一类分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段。EcoRI是最早发现的II型限制性内切酶III型限制性内切酶：识别一定的位点，但切割位点通常在识别位点一侧24bp-26bp处

I型限制性内切酶和III型限制性内切酶的切点不固定，不能产生可利用的DNA片段。II型限制性内切酶具有控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段。基因工程所用的限制性内切酶都是II型限制性内切酶II型限制性内切酶的识别特点和切割特性：①II型限制性内切酶识别序列的长度，一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基；②其识别位点一般都是回文结构；③产生不同的末端：黏性末端、平齐末端

黏性末端：限制性内切酶错位切割DNA双链而形成的互补的单链末端（双链DNA中没有配对的碱基末端）

平齐末端：有些限制性内切酶在同一位点平齐切割DNA两条链，而形成两端平整的DNA分子

同裂酶：是指来自不同有机体但识别和切割相同DNA序列的酶

同尾酶：来源不同，识别序列不同，但切割DNA分子后产生的黏性末端相同

杂种位点：由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别

限制性内切酶的主要用途：

①在特异性位点上切割DNA，产生特意新限制性内切酶切割的DNA片段②建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱

③用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA ④构建基因图库

DNA聚合酶：以DNA为模板，将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶。

常用：大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）、耐热DNA聚合酶、逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）、T4噬菌体DNA聚合酶、 T7噬菌体DNA聚合酶及其改造的测序酶

Klenow片段作用：①补平限制性内切酶切割DNA所产生的3’凹端②以（32P）标记的dNTP补平3’凹端，可对DNA分子进行末端标记③对DNA分子的3’突出尾进行末端标记④在cDNA克隆中，用于

合成cDNA第二链⑤应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序

耐热DNA聚合酶的作用：①DNA测序②通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增

DNA连接酶：能够将两段DNA拼接起来的酶叫做DNA连接酶

连接酶分类：①大肠杆菌连接酶（需要NAD+，只能连接黏性末端DNA片段）

②T4噬菌体DNA连接酶（需要ATP，能连接黏性末端，也能连接平齐末端）

影响连接反应的因素：①温度②DNA末端特性③DNA末端的浓度和分子量

碱性磷酸酯酶：是催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5’磷酸基，即脱磷酸作用

S1核酸酶：来源：是从米曲霉中提取的

活性：特异性单链核苷酸外切酶，能降解单链DNA和单链RNA，不能降解其双链DNA和RNA的杂合子

DNA分子

理想载体的特征：

①插入外源基因前后均能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制

②有适当的限制性内切酶单一酶切位点，且位于DNA复制的非必需区

③具有能够直接观察的表型特征，作为重组DNA选择的标志。

④易于从宿主细胞中分离，并进行纯化

载体的分类：①按照介导的作用目的（克隆载体、表达载体）②按照导入的受体生物（原核生物大肠杆菌载体、酵母载体、植物载体、动物载体）③根据赋予宿主的形状（F质粒、R质粒、降解质粒）原核生物载体：细菌质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、柯斯质粒载体

蓝白斑筛选重组子的原理：lacZ编码β半乳糖苷酶的α肽，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷的诱导下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解为半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝色菌落。外源基因的插入使α肽失活，因此携带外源基因的重组子菌落呈白色

λ噬菌体DNA：λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp。两端各有12个碱基的5’凸出，黏性末端是互补的，进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。

包含3个部分：①左臂（构成头部和尾部外壳蛋白基因）②中臂（非必需区，可用于改造）③右臂（λDNA 复制和溶菌有关的蛋白质编码基因）

柯斯质粒载体：一类由人工构建的含有λDNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。也叫黏性质粒或黏粒基因组组成：①1个质粒复制起始区域复制子②1个λ噬菌体黏性末端片段cos位点

③至少1个限制酶的单一识别切割位点④至少1个抗药性选择标记基因

特点：①具有质粒载体的特性②具有λ噬菌体载体的特性

③具有高容量的克隆能力。可插入30-45kb的外源DNA

基因工程的受体：基因工程的受体是指在转化、转导、杂交中接受外源基因，并能支持质粒、病毒进行复制扩增和表达的细胞或生物体，受体也叫宿主

受体应具备的性能：①具有接受外源基因的能力，并利于表达②能表达由导入的重组体分子提供的某些表型特征，以利于转化子细胞的选择和鉴定③不适合于在人体体内或非培养条件下生存，有利于安全

：①目的基因的制备②目的基因与载体的重组

③重组体DNA导入受体细胞④克隆子和筛选与表达产物的检测

目的基因：是指根据基因工程的目的和设计所需要的某些DNA分子的片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码制备方法：

①目的基因的直接分离法（限制性内切酶法、物理化学法、酶促逆转录合成法）

②基因文库筛选法（鸟枪法、基因组文库法、cDNA文库法）

③聚合酶链式反应法④基因的化学合成法

酶促逆转录合成法：利用逆转录酶以mRNA为模板合成相应的DNA方法。主要用于合成分子量大而又不知其序列的基因基因组文库：指汇集某一基因组所有DNA序列的重组DNA群体。通常是以λ噬菌体作为载体构建的

cDNA文库：以某种生物成熟的mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。常以λ噬菌体和质粒作为载体构建

聚合酶链式反应法（PCR）：当知道目的基因的序列或其两侧的序列时，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物，十分有效的扩增出含有目的基因的DNA片段

反应体系：①作为模板的目的DNA序列②与目的基因两条链的各自3’端序列互补的DNA引物

③TaqDNA聚合酶④4种核苷酸4×dNTP ⑤反应buffer：Mg2+

基本过程：①变性（高温90-96℃下使DNA分子解链）②退火（降温25-65℃使DNA分子重新配对，引物与模板结合）③延伸（72℃下，Taq酶作用，合成DNA分子）