多杀菌素补料发酵工艺的研究

多杀菌素补料发酵工艺的研究

邹球龙;郭伟群;王超;胡翔;韩伟;张晓琳

【摘要】利用30 L及50 L发酵罐,通过控制pH和补料优化多杀菌素发酵工艺,提高多杀菌素的产量.采用优化后的补料发酵工艺,多杀菌素的发酵产量可达1 050 μg/mL,较对照575 μg/mL提高82％.为多杀菌素的工业化生产提供了依据.

【期刊名称】《粮油食品科技》

【年(卷),期】2014(022)003

【总页数】3页(P86-88)

【关键词】刺糖多孢菌;多杀菌素;补料发酵工艺

【作者】邹球龙;郭伟群;王超;胡翔;韩伟;张晓琳

【作者单位】国家粮食局科学研究院,北京100037;国家粮食局科学研究院,北京100037;国家粮食局科学研究院,北京100037;国家粮食局科学研究院,北京100037;国家粮食局科学研究院,北京100037;国家粮食局科学研究院,北京100037

【正文语种】中文

【中图分类】TQ920.6

多杀菌素，又名刺糖菌素，是土壤放线菌刺糖多孢菌经有氧发酵产生的次级代谢产物，属大环内酯类化合物。可有效防治鳞翅目、双翅目、缨翅目、鞘翅目及膜翅目等多种害虫［1－2］。多杀菌素及其衍生物兼有生物农药的安全性和化学合成农

药的速效性，因其具有低毒、低残留、对人安全、对非靶标动物和环境安全、自然分解快等优点，曾先后于1999年、2008年、2010年三次获得美国“总统绿色化学品挑战奖(Presidential Green Chemistry Challenge A-ward)”［3－4］。我国对多杀菌素的研究还处于试验阶段，尚无工业化生产的相关报道。现阶段多杀菌素的研究热点主要集中在全合成和分子改造上［5－6］。国内多杀菌素发酵水平较低，需进一步选育高产菌株，提高发酵工艺水平。本研究利用30 L及50 L发酵罐对经过多次诱变选育获得的多杀菌素高产菌株进行培养基配方改良和发酵工艺优化，研究补料发酵工艺，为多杀菌素的工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

15 L发酵罐，德国satorius集团;30 L及50 L发酵罐，镇江东方生物工程设备有限公司;SBM/SSX摇床，瑞士Kuhner公司;Nova BioProfile 300多参数分析仪，美国Nova公司;Waters 515/2487型高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.2 菌种与培养基

1.2.1 菌种

刺糖多孢菌ASAGF73，本实验室保存。

1.2.2 培养基［7－8］

斜面及平板培养基(g/L):葡萄糖5.0，牛肉膏3.0，酪蛋白胨 0.25，琼脂 18.0。pH 7.2 。

种子培养基(g/L):葡萄糖 15.0，可溶性淀粉10.0，豆饼粉 3.0，棉籽蛋白 3.0，大豆蛋白胨 25.0，MgSO42.0。pH 7.2。

发酵培养基(g/L):葡萄糖 70.0，棉籽粉 20.0，NaCl 3.0，K2HPO4·3H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，CaCO31.0。大豆油 3 mL/L，pH 7.0。

上述培养基12l℃灭菌30 min，葡萄糖单独115℃灭菌25 min。

发酵罐培养基同摇瓶，培养基121～124℃在位灭菌30 min。灭菌后pH在6.5～7.0之间。

培养条件:接种量10%，培养温度29℃，摇瓶转速为240 r/min，发酵罐通过搅拌将溶氧控制在40% 以上。

1.3 实验方法

1.3.1 基础培养基优化本实验利用摇瓶在原发酵培养基的基础上添加0.3%～0.7%的酵母提取物及0.4%～1.6%玉米浆干粉进行氮源优化。

1.3.2 补料发酵工艺优化

1.3.

2.1 pH的优化流加稀盐酸调节 pH，将 pH分别控制在 6.5、7.0、7.5 和 8.0。

1.3.

2.2 残糖水平优化补料工艺中，将基础葡萄糖添加量由60 g/L降至30 g/L，

将残糖控制在不同水平，对照为原工艺。

1.4 相关参数检测

(1)糖、氮的测定:总糖测定参照山东科学院SGD－Ⅳ全自动还原糖测定仪仪器说明书;葡萄糖及氨态氮测定参照Nova BioProfile 300多参数分析仪仪器使用说明书。

(2)生物量的测定:PMV法，发酵液4 000 r/min离心15 min，计算沉淀固体占发酵液的质量百分比。

(3)多杀菌素发酵产量的测定［9］:取发酵液2 mL，加入无水甲醇4 mL，充分振

荡30 min，转速4 000 r/min离心10 min，上清14 000 r/min离心5 min，上清液用HPLC测定多杀菌素的产量。色谱条件:waters高效液相色谱仪:C18反相

柱(250 mm×4.0 mm);流动相为甲醇∶乙腈∶水=45∶45∶10(v/v/v，其中水含0.05%乙酸铵);流速1.0 mL/min;检测波长244 nm;进样量10 μL;柱温25℃。

2 结果与分析

2.1 基础培养基优化

由于多杀菌素发酵属于部分生长偶联型发酵［10］，且主要在稳定期合成多杀菌

素［11］，因此，只有生物量达到一定量之后，发酵后期多杀菌素产量才能进一步提高。刺糖多孢菌ASAGF73在发酵过程中生长缓慢、延滞期长。酵母提取物和玉米浆干粉营养丰富，常作为速效有机氮源，适量添加酵母提取物和玉米浆干粉有利于菌丝生长。因此在本实验中以生物量为主要目标在不影响前期发酵产量的前提下进行了酵母提取物及玉米浆干粉的筛选。

2.1.1 酵母提取物对生物量及多杀菌素产量的影响发酵配方中分别添加质量分数为0.3%的酵母浸膏和酵母浸粉，对照为不添加酵母提取物。

表1 不同酵母提取物对生物量及多杀菌素产量的影响?

结果表明，酵母提取物有利于菌体的生长，在添加酵母提取物的各组中，生物量及多杀菌素产量均大于不添加酵母提取物的对照组(表1)。另与酵母浸粉相比较，酵母浸膏更有利于发酵产量的增长。

酵母浸膏最适浓度的筛选结果见表2。胞内代谢产物的产量受生物量影响较大，生物量提高，后期产素相应提高，由表2可知，在酵母浸膏浓度为0.5%时，生物量最大，此时多杀菌素发酵产量最高。所以采用0.5%的酵母浸膏。

表2 酵母浸膏浓度优化结果?

2.1.2 玉米浆干粉对生物量及多杀菌素产量的影响在固定0.5%酵母浸膏的基础培养基中，添加不同比例的玉米浆干粉。分别培养不同时间后测定生物量及产量，结果如表3所示。摇瓶筛选结果表明添加一定量的玉米浆干粉有利于菌丝生长。随着玉米浆干粉浓度的不断增加，生物量及产量先呈上升趋势，在浓度为1.0%时都达到最高。但是速效氮源也存在类似于葡萄糖的阻遏效应［12］，随着玉米浆干粉的继续增加，生物量的变化表现出抑制作用。

表3 玉米浆干粉浓度对生物量及多杀菌素产量的影响?

通过上述摇瓶筛选，在原有发酵培养基的基础上，添加0.5%酵母浸膏和1.0%的玉米浆干粉作为初始发酵培养基进行发酵罐实验。