细菌内毒素检测标准
细菌内毒素检查讲解
（3）供试品阳性对照液（B）的制备 取1.0ml供试品，加入1.0ml上述C溶液即得。 （4）阴性对照（D）的制备
直接使用BET水。
取8只鲎试剂，分别加0.1mLBET复溶，在分别加入A、 B、C、D组溶液各0.1mL （每组2管） 。加样结束后，用 封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入
37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟，观察并记录结果。
利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的 现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否 符合规定的一种方法。
旋涡混合器 鲎试剂（λ=0.5EU/ml） 恒温水浴器（37℃±1℃） 细菌内毒素工作标准品 精密移液枪 无热原吸头（100μL、 1mL） （CRE，10EU） 细菌内毒素检查用水（BET） 安瓿架 封口膜 5%葡萄糖注射液 脱脂棉和无菌纱布 标签纸和记号笔 剪刀 表
供试品细菌内毒素的检查
按下表制备溶液A、B、C和D。
编号 A 内毒素浓度/配制内毒素 的溶液 无/供试品溶液 平行管 数 2 供试品溶液
B
C
2λ/供试品溶液
2λ/检查用水
2
2
供试品阳性对照
阳性对照
D
无/检查用水
2
阴性对照
（1）供试品溶液（A）的配制
取供试品1.0ml，加入1.0ml的BET水，即得供试品溶 液。 （2）阳性对照液（C）的配制 用BET水将CSE制成 2λ浓度的内毒素溶液。
供试品Leabharlann 供试品阳性对照阳性对照阴性对照
1号 2号
结果是否有效 结果判断
1号 2号
1号 2号
1号 2号
思考题
（1）试验设置阳性对照、阴性对照的意义是什么？ （2）试验中如果出现阴性对照为阳性，该如何处理？ （3）供试品阳性对照液如何配制？
细菌内毒素检查SOP(动态浊度法)
细菌内毒素检查SOP（动态浊度法）1．目的为规范细菌内毒素含量测定的操作，特制定本SOP。
2．范围本SOP适用于细菌内毒素含量测定的操作。
3．定义3.1.动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
3.2.细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
3.3.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
3.4.细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015 EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
4．职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3.质量负责人/质量受权人负责本规程的批准。
4.4.QA负责本规程执行的监督。
5．引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部。
6．材料6.1.仪器设备细菌内毒素测定仪、漩涡混合器、干烤箱6.2.试剂及溶液6.2.1.鲎试剂6.2.2.细菌内毒素工作标准品：国家标准品或经过国家标准品标定的工作标准品。
6.2.3.细菌内毒素检查用水：内毒素含量应小于0.005EU/ml。
6.3.使用的器具移液器、无热原稀释管和反应管、无热原枪头。
7．流程图无8．程序8.1.原理细菌内毒素能激活鲎试剂(TAL)中的酶系统，使凝固酶原变成凝固酶，进而凝固酶再激活其中的凝固蛋白原变成凝固蛋白，呈现凝胶反应，动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，计算内毒素浓度与反应时间关系的双对数标准曲线，利用标准曲线对供试品的内毒素含量进行定量测定。
8.2.试验前准备8.2.1.采样管用硅胶塞塞口，经180℃干烤2小时，除内毒素备用。
中华人民共和国国家标准细菌内毒素检测方法
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。
用以代替家兔法对供试品进行热原初试。
本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。
其他产品可参照使用。
二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。
三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。
2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。
3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。
4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。
四、试验前准备1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。
玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。
2、鲎试剂灵敏度测定（1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。
（2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。
取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。
取10mm×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。
最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。
五、试验方法1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。
2、浸提介质:无热原水。
3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
药典三部(版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法之老阳三干创作本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌发生的细菌内毒素, 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法.细菌内毒素检查包括两种方法, 即凝胶法和光度测定法, 后者包括浊度法和显色基质法.供试品检测时, 可使用其中任何一种方法进行试验.当测定结果有争议时, 除另有规定外, 以凝胶限度试验结果为准.本试验把持过程应防止内毒素的污染.细菌内毒素的量用内毒素单元（EU）暗示, 1EU与1个内毒素国际单元（IU）相当.细菌内毒素国家标准品系自年夜肠埃希菌提取精制而成, 用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价, 干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价, 用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准, 其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）, 且对内毒素试验无干扰作用.试验所用的器皿需经处置, 以去除可能存在的外源性内毒素.耐热器皿经常使用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除, 也可采纳其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法.若使用塑料器皿, 如微孔板和与微量加样器配套的吸头等, 应选用标明无内毒素而且对试验无干扰的器具.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液.需要时, 可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值, 一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜, 可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值.酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制.缓冲液必需经过验证不含内毒素和干扰因子.内毒素限值简直定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值, 一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单元）暗示；K为人每千克体重每小时最年夜可接受的内毒素剂量, 以EU/（kg·h）暗示, 注射剂K=5 EU/（kg·h）, 放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h）, 鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最年夜供试品剂量, 以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）暗示, 人均体重按60kg计算, 人体概况积按1.62㎡计算.注射时间若缺乏1小时, 按1小时计算.供试品每平方米体概况积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）.按人用剂量计算限值时, 如遇特殊情况, 可根据生产和临床用药实际情况做需要调整, 但需说明理由.确定最年夜有效稀释倍数（MVD）最年夜有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最年夜倍数（1→MVD）, 在不超越此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测.用以下公式来确定MVD：MVD=cL/λ式中 L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度, 当L以EU/mg或EU/U暗示时, c 的单元需为mg/ml或U/ml, 当L以EU/ml暗示时, 则c即是1.0ml/ml.如需计算在MVD时的供试品浓度, 即最小有效稀释浓度, 可使用公式c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）, 或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度.方法1 凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素发生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法.鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下, 使鲎试剂发生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度, 用EU/ml标示.当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时, 应进行鲎试剂灵敏度复核试验.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）, 将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解, 在旋涡混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液, 每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒.取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支.其中16管分别加入0.1ml分歧浓度的内毒素标准溶液, 每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对比.将试管中溶液轻轻混匀后, 封闭管口, 垂直放入37℃±1℃的恒温器中, 保温60分钟±2分钟.将试管从恒温器中轻轻取出, 缓缓倒转180°, 若管内形成凝胶, 而且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性.保温和拿取试管过程中应防止收到振动, 造成假阴性结果.当最年夜浓度2λ管均为阳性, 最低浓度0.25λ管均为阴性, 阴性对比管为阴性, 试验方为有效.按下式计算反应终点浓度的几何平均值, 即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）.λc=antilg（∑X/n）式中 X为反应终点浓度的对数值（lg）.反应终点浓度是指系列递加的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；n为每个浓度的平行管数.当λc在0.5～2λ（包括0.5λ和2λ）时, 方可用于细菌内毒素检查, 并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度.干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D, 使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超越最年夜有效稀释倍数（MVD）的溶液, 按鲎试剂灵敏度复核试验项下把持.表1 凝胶法干扰试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对比系列；D为阴性对比.只有当溶液A和阴性对比溶液D的所有平行管都为阴性, 而且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 试验方为有效.当系列浓度B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 认为供试品在该浓度下无干扰作用.其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用.若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰, 应将供试品溶液进行不超越MVD的进一步稀释, 再重复干扰试验.可通过对供试品进行更年夜倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处置等）排除干扰.为确保所选择的处置方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性, 要使用预先添加了标准内毒素再经过处置的供试品溶液进行干扰试验.当进行新药的内毒素检查试验前, 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时, 须进行干扰试验.当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变动时, 须重新进行干扰试验.检查法⑴凝胶限度试验按表2制备溶液A、B、C和D.使用稀释倍数不超越MVD而且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B.按鲎试剂灵敏度复核试验项下把持.表2 凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对比；C为阳性对比；D为阴性对比.结果判断保温60分钟±2分钟后观察结果.若阴性对比溶液D的平行管均为阴性, 供试品阳性对比溶液B的平行管均为阳性, 阳性对比溶液C的平行管均为阳性, 试验有效.若溶液A的两个平行管均为阴性, 判定供试品符合规定.若溶液A的两个平行管均为阳性, 判定供试品不符合规定.若溶液A的两个平行管中的一管为阳性, 另一管为阴性, 需进行复试.复试时溶液A需做4支平行管, 若所有平行管均为阴性, 判定供试品符合规定, 否则判定供试品不符合规定.若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A呈现不符合规按时, 需将供试品稀释至MVD重新实验, 再对结果进行判断.⑵凝胶半定量试验本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量.按表3制备溶液A、B、C和D.按鲎试剂灵敏度复核试验项下把持.结果判断若阴性对比溶液D的平行管均为阴性, 供试品阳性对比溶液B的平行管均为阳性, 系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5～2λ, 试验有效.系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ, 为每个系列的反应终点浓度.如果检验的是经稀释的供试品, 则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数, 即获得每一系列内毒素浓度c.若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值, 判定供试品符合规定.每一系列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式cE=antilg（∑c/2）].若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性, 应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品, 则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）.若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时, 则判定供试品不符合规定.当供试品溶液的所有平行管均为阳性, 可记为内毒素的浓度年夜于或即是最年夜的稀释倍数乘以λ.表3 凝胶半定量试验溶液的制备注：A为不超越MVD而且通过干扰试验的供试品溶液.从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍, 最后的稀释倍数不得超越MVD.B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对比）.C为鲎试剂标示灵敏度的对比系列.D为阴性对比.方法2 光度测定法光度测定法分为浊度法和显色基质法.浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变动而测定内毒素含量的方法.根据检测原理, 可分为终点浊度法和静态浊度法.终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法.静态浊度法是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度或透光率所需的反应时间, 或是检测浊度增加速度的方法.显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中发生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的几多而测定内毒素含量的方法.根据检测原理, 分为终点显色法和静态显色法.终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法.静态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间, 或检测值增加速度的方法.光度测定试验需在特定的仪器中进行, 温度一般为37℃±1℃.供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等, 参照所用仪器和试剂的有关说明进行.为保证浊度和显色试验的有效性, 应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验.标准曲线的可靠性试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时, 需进行标准曲线的可靠性试验.用标准内毒素制成溶液, 制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得年夜于10倍）, 最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限.每一稀释步伐的混匀时间同凝胶法, 每一浓度至少做3支平行管.同时要求做2支阴性对比, 当阴性对比的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间年夜于标准曲线最低点的反应时间, 将全部数据进行线性回归分析.根据线性回归分析, 标准曲线的相关系数（r）的绝对值应年夜于或即是0.980, 试验方为有效.否则须重新试验.干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm）, 作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度.按表4制备溶液A、B、C和D.表4 光度测定法干扰试验溶液的制备注：A为稀释倍数不超越MVD的供试品溶液.B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的, 且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液.C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的, 用于制备标准曲线的标准内毒素溶液.D为阴性对比.按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs, 再按下式计算该试验条件下的回收率（R）.R=(csct)/λm×100%当内毒素的回收率在50%～200%, 则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用.当内毒素的回收率不在指定的范围内, 须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素, 偏重复干扰试验来验证处置的有效性.当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变动时, 须重新进行干扰试验.检查法按“光度测定法的干扰试验”中的把持步伐进行检测.使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度.试验必需符合以下三个条件方为有效：⑴系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；⑵用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后, 计算出的内毒素的回收率要在50%～200%的范围内；⑶阴性对比的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间年夜于标准曲线最低点的反应时间.结果判断若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后, 小于规定的内毒素限值, 判定供试品符合规定.若年夜于或即是规定的内毒素限值, 判定供试品不符合规定.注：本检查法中, “管”的意思包括其他任何反应容器, 如微孔板中的孔.。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K／M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(k g•h)表示。
其中注射剂，K=5EU／(k g•h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(k g•h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(k g•h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(k g•h)、mg／(k g•h)、U／(k g•h)表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD＝CL/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-073细菌内毒素检查法第2页共18页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草吴雅凝λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C：λ／L。
药典三部(版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。
范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。
责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。
二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。
四、旋涡混合器。
五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。
七、细菌内毒素工作品。
八、凝胶法细菌内毒素检查用水。
九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。
所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。
操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。
2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。
（可存放多长时间）。
3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。
二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程1 简述1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.2 供试品细菌毒素限值的确定。
（一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；（二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。
其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂，K=0.2EU/kg/h。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算：MV D=C·L/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml或U/ml。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。
细菌内毒素检测标准
细菌内毒素检测标准
细菌内毒素检测的标准通常由相关监管机构或行业组织制定。
以下是一些常见的细菌内毒素检测标准：
1. 中国标准：GB/T 18979-2003《食品中内毒素的测定鲎试剂法》是中国关于细菌内毒素检测的国家标准，该标准规定了使用鲎试剂法测定食品中内毒素的试验方法和要求。
2. 美国标准：FDA（美国食品药品监督管理局）制定了关于细菌内毒素检测的联邦法规，如21 CFR 11
3.320（f），规定了食品中内毒素的检测方法和限量。
3. 欧洲标准：欧洲食品安全局（EFSA）对细菌内毒素的检测方法有详细的指南，如针对水产品中的副溶血性弧菌内毒素的检测方法。
4. ISO标准：ISO 11298-1《医学器械细菌内毒素的测定》是国际标准化组织（ISO）制定的关于细菌内毒素检测的国际标准。
这些标准通常涵盖了检测方法、试验条件、结果分析等方面，以确保检测结果的准确性和可靠性。
需要注意的是，不同国家和地区的标准可能存在差异，因此在进行细菌内毒素检测时，应遵循当地相关法规和标准要求。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素供试250℃、30供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
注射时间若不足1小时，按1小时计算。
供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说，当L毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。
取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支。
其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法细菌内毒素是一种由细菌产生的毒素，它们可以导致各种疾病和感染。
为了检测细菌内毒素的存在，有几种常用的方法。
1. 酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验是一种常用的检测细菌内毒素的方法。
它基于抗体与特定细菌内毒素结合的原理。
首先，在试验板上固定特异性的抗体，然后加入样本溶液。
如果样本中含有目标细菌内毒素，它们将与固定的抗体结合。
接下来，通过冲洗去除未结合的物质，并加入与抗体结合的酶标记二抗。
最后，染色物质被加入，形成颜色反应，测量其光密度即可检测细菌内毒素的存在。
2. 质谱分析质谱分析是一种高分辨率的检测细菌内毒素的方法。
它使用质谱仪来分析样品中的化学成分。
首先，样品通过质谱中的电离源产生离子。
然后，质谱仪以不同的方式对离子进行分离和检测，以确定其质量和相对丰度。
通过与已知细菌内毒素的质谱图进行比对，可以确定样品中是否存在目标内毒素。
3. 生物感应器生物感应器是一种基于生物反应的检测细菌内毒素的方法。
它使用已知对细菌内毒素具有特异性反应的生物分子，如细胞、抗体或酶等。
当目标内毒素存在时，它们与生物分子结合，触发特定的生物反应。
通过测量或监测这些反应的信号变化，可以确定细菌内毒素的存在。
4. 培养试验培养试验是一种传统的检测细菌内毒素的方法。
它通过将样品接种到特定培养基上，培育细菌并观察是否产生内毒素。
一般来说，细菌内毒素的产生需要一定的时间，而且对培养条件和培养基的选择也有一定的要求。
因此，这种方法可能需要更长的时间和更复杂的实验条件。
上述方法各有优缺点，选择适合的方法需要根据具体情况和需求进行。
综合考虑灵敏度、准确性、快速性和成本等因素，可以选择最适合的方法来检测细菌内毒素的存在。
细菌培养和内毒素标准
透析用水质控的六个要素
保证原水质量 有效的前水处理 双级反渗装置 下水管道设施 透析机连接管路 反渗水分配系统
化学污染物 01
细菌培养 03
透析用水 的五种检
测
02 内毒素检测 04 软水硬度
05
游离氯检测
细菌培养
每月一次
Q1
如若结果超标，需重新消毒机器再检 测
Q3
透析液为透析旁路的入水口
Q3
在线生成的置换液应该无菌并且没有致热源
透析液微生物检测取样方法
内毒素检测取样
细菌检测取样
透析用水和透析液内毒素检测方法
定性检测: 简单，方便，12-20分钟出结果。
定量检测: 配套专用仪器和软件, 自动检测分析，一步即成。
透析用水和透析液内毒素检测的意义
内毒素，水解后可以穿过透析膜进入到患者的体内， 导致急性热原性反应。使患者产生低血压，肌肉痉挛， 头痛，发热等症状，严重的可导致休克。
透析用水取样口
供水回路末端取样口
U型连接取样口
透析液
血液透析装置按指定比例，将透析用水、酸性浓 缩物和碳酸氢盐浓缩物配制成的溶液,用于临床透 析治疗。
透析液的纯净度要求
标准透析液
细菌含量<100cfu/ml 内毒素含量<0.5EU/mI
超纯透析液
细菌含量<0.1cfu/ml 内毒素含量<0.03EU/ml
的血液与内毒素接触
预处理部分:建后议会活发生性特炭异采性用的双凝罐结构,增加反冲 频洗率 困，难控，制消微毒集 量生意反 研物义应 究生甚， 和长微人 实们 验。。经 从预过它处大的理化学消毒后清
透析用水和透析液微生物检测超标
1
立即复测。避免采样过程以及送验过程的误差。
药品gmp 细菌内毒素检测标准
药品GMP（Good Manufacturing Practice，良好生产规范）是确保药品质量和安全的国际标准，它涵盖了从原材料采购到生产制造、成品检验和质量控制等方方面面。
细菌内毒素检测标准在药品GMP中扮演着至关重要的角色，因为细菌内毒素是一种可能存在于药品中的有害物质，对人体健康造成严重危害。
本文将从深度和广度两方面探讨药品GMP中细菌内毒素检测标准的重要性、相关要求和实施方法。
一、药品GMP概述1.1 药品GMP的意义药品GMP是指针对药品生产过程中的所有环节，包括原辅料的采购和检验、药品生产和包装等，制定一系列的规范要求，目的是保证药品质量和安全性，保护人民群众的身体健康，维护国家药品市场秩序。
1.2 药品GMP的基本原则在GMP标准下，药品生产企业需要建立质量管理体系，包括生产工艺的严格控制、设备和环境的清洁与消毒、员工的培训和管理等，以确保每一批药品都能达到质量标准，不会对患者产生危害。
1.3 药品GMP的国内外认证体系国际上常见的药品GMP认证标准有FDA、EU GMP、WHO GMP等，国内也有CFDA发布的《药品GMP认证管理办法》。
药品生产企业需要依照相关标准进行认证，以取得原料药或制剂的GMP证书。
二、细菌内毒素检测标准在药品GMP中的重要性2.1 细菌内毒素的危害细菌内毒素是一种由细菌产生的有害物质，即便细菌已经被杀灭，细菌内毒素仍然存在，对人体造成危害。
在药品中，含有细菌内毒素的药物会引起副作用甚至危及患者生命。
2.2 国际标准对细菌内毒素的要求国际上对药品GMP的细菌内毒素检测标准有着明确要求，包括检测方法、检测限和检测频率等。
药品生产企业需要建立完善的细菌内毒素检测体系，确保生产的每一批药品都符合标准。
2.3 细菌内毒素检测在生产中的应用在药品生产过程中，细菌内毒素检测是一个必不可少的环节。
生产企业需要对原辅料、中间体和成品进行细菌内毒素检测，确保药品的质量和安全性。
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细菌内毒素检测标准
一、范围：
本试验为《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定的“凝胶法”，系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理，经判定供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。
二、依据：
GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法。
第二部分：生物学试验方法。
《中华人民共和国药典》2010年版二部
三、器具及试剂：
1.器材：
（1）锥形瓶
（2）三角烧瓶
（3）无热原剪刀、镊子
（4）恒温培养箱
（5）超净工作台
（6）恒温水浴箱
（7）电热干燥箱
（8）旋涡混合器
（9）移液器
2.试剂：
（1）细菌内毒素国家标准品
（2）细菌内毒素工作标准品
（3）鲎试剂
（4）细菌内毒素检查用水
四、实验前准备：
1.器具处理：
试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素。
玻璃器皿置电热干燥箱内1800C干烤至少2h，或2500C干烤至少30min。
塑料器皿置30%双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒检查用水充分冲洗后置600C烘干备用。
2.鲎试剂灵敏度复核实验：
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度试验。
试验步骤按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定进行。
3.供试品干扰实验：
（1）对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，以检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。
当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何影响细菌内毒素试
验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰实验。
（2）每种产品应取3批并分别使用不少于两个制造商生产的鲎试剂进行干扰实验。
供试液制备按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”规定进行。
（3）如供试品对细菌内毒素试验有干扰作用，可选用下列适宜方法排除干扰：
a)使用更灵敏的鲎试剂对供试品进行更大倍数稀释;
b)采用无热原氨基甲烷缓冲液稀释供试液;
c)采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液pH值在6.0-8.0范围;
d)采用阳离子缓冲（MgSO4或MgCl2）稀释供试液以调节离子浓度。
五、检验步骤：
1.供试品数量：同一批号至少3个单位供试品。
2. 浸提介质：细菌内毒素检查用水
3.供试液制备：将小型配件及多功能手术解剖器具置无热原玻璃器皿内，加入细菌内毒素
检查用水振摇数次，在（37±1）0C恒温箱中浸提不少于1h.（根据产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质体积）
4.试验步骤及结果判定：
按下表制备溶液A、B、C和D.使用稀释倍数为MVD并且已排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B.按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
凝胶限量试验溶液的制备
结果判定：保温60min±2min后观察结果。
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，则试验有效。
若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性判供试品不符合规定。
若溶液A的平行2管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定;否则判供试品不符合规定。