流式细胞术实验方法及应用
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原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ） 全血50ul（5×105）+10ul相应抗体→避光孵 育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次 →上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞 内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞 膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂：
0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定破膜剂（A、B）。
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
臵 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
体时，将DNA含量直
方图分为三部分，
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇
4º ，24h C
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞
流式细胞术实验方法及应用
何玉萍
科研型
分选功能 488nm激光
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
四色荧光
(525、575、610
、675nm）
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的 研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒， 经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细 胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧 光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧 光信号可以反映细胞的生物特性。
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时， 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
2、 淋巴细胞亚群分析
白细胞分化抗原（CD分子）的命名：
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
610（红） 667（红） 767（红外） 660（红）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
633
767（ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ外）
2. 要有高的光子产量---提高信号强度。
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体
CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
激光
前向散射
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
侧向散射，荧光信号
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近30年来流式细胞术在我国得到很 快的发展，应用范围不断增大。目前， 流式细胞术作为一门生物检测技术广泛 应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞 遗传学、细胞生物学、生物化学等临床 医学和基础医学研究领域。
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
离心
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 离心 100目钢筛网 PBS洗2次 300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
CD3+
CD3+CD8+ CD3+CD4+
NK+/CD3-
CD（16+56）+/CD3+ （T-cell）
NK细胞: CD(16+56)+/CD3-
CD19+/CD3-
CD19+/CD3+ （T-cell）
B淋巴细胞: CD19+/CD3-
外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）
50ul+10ul相应抗体 避光孵育15min 室温10min 加OptiLyes C溶血素250ul
FSC
SSC
九、流式细胞术的应用及标记方法
1、DNA含量分析 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的 增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发 生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期 （4C）。
2C→4C
2C
4C
FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对 DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特 异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧 光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧 光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍
流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类 计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞 免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一 群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及 膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋 巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个 亚群。
T淋巴细胞（CD3+） 淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+
剪成小块 PBS 洗2次
剪至浆状
制备仪
2-3min
300目尼龙网过滤
离心
剪碎法
1000r/min，5min
单细胞悬液。
吸管轻轻吹打
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 单细胞悬液。
醇乙脱水： 70％→80%→90％→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石 蜡包埋 脱蜡水化： 二甲苯脱蜡→ 100％醇乙 →90%→80%→70％→50％ →蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片
乙醇，蒸馏水
二甲苯脱蜡 胰蛋白酶
1-2天
水化
组织器官
37℃，15-30min
冰PBS 过滤 离心 液
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会， 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、 命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
六、荧光染色对照设臵(空白对照
同型对照 )
、阳性对照、阴性对照、
1、空白对照
用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板
胰蛋白酶
吸去培养液
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次
含血清的培养基
吹打
PBS洗2次
单细胞悬液。
3. 组织器官单细胞悬液的制备
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加
入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原--抗 体--抗体复合物。其操作复杂、费时，目前
兔抗小鼠
小鼠
很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直
接抗体，只能采用此方法。 直接标记是在标记时加入连接着荧光素
直
标
的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用
于各实验室。
根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内 抗
3. 对激光有强的吸收----降低背景噪音。
4. 激发光谱和发射光谱之间差距大---减少
干扰。
5. 易与被标记的物质结合，而不影响被标记 物的特异性。 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂 和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析：
双色分析：FITC与PE
三色分析：双色分析+PE-CY5
单细胞悬液
胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝
素液，臵于4℃ 冰箱中静臵 6-12h
尿 液：收集24h 尿液，臵4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内臵 6-12h
间
标
羊抗兔
五、荧光标记
主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一
二、流式细胞术的特点、优点
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个 细胞，甚至几万个细胞。
多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
七、荧光补偿
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误 差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
酶消化法
组织器官
机械法
单细胞制备仪 剪碎法 网搓法 研磨法
（1）、酶消化法
组织块洗去血液
37℃，15-30min
剪成小块
胰蛋白酶
100目 单
含血清的培养基 PBS 洗2次
钢筛网过滤
离心
300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
细胞悬液。
（2）、机械法
单细胞制备仪
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
激发光波长（nm ）
异硫氰酸（FITC） 488 发射波长(nm) 525（绿）
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大， 散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反 映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该 道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数； 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞 内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞 膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂：
0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定破膜剂（A、B）。
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
臵 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
体时，将DNA含量直
方图分为三部分，
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇
4º ，24h C
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞
流式细胞术实验方法及应用
何玉萍
科研型
分选功能 488nm激光
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
四色荧光
(525、575、610
、675nm）
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的 研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒， 经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细 胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧 光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧 光信号可以反映细胞的生物特性。
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时， 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
2、 淋巴细胞亚群分析
白细胞分化抗原（CD分子）的命名：
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
610（红） 667（红） 767（红外） 660（红）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
633
767（ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ外）
2. 要有高的光子产量---提高信号强度。
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体
CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
激光
前向散射
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
侧向散射，荧光信号
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近30年来流式细胞术在我国得到很 快的发展，应用范围不断增大。目前， 流式细胞术作为一门生物检测技术广泛 应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞 遗传学、细胞生物学、生物化学等临床 医学和基础医学研究领域。
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
离心
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 离心 100目钢筛网 PBS洗2次 300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
CD3+
CD3+CD8+ CD3+CD4+
NK+/CD3-
CD（16+56）+/CD3+ （T-cell）
NK细胞: CD(16+56)+/CD3-
CD19+/CD3-
CD19+/CD3+ （T-cell）
B淋巴细胞: CD19+/CD3-
外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）
50ul+10ul相应抗体 避光孵育15min 室温10min 加OptiLyes C溶血素250ul
FSC
SSC
九、流式细胞术的应用及标记方法
1、DNA含量分析 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的 增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发 生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期 （4C）。
2C→4C
2C
4C
FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对 DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特 异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧 光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧 光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍
流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类 计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞 免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一 群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及 膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋 巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个 亚群。
T淋巴细胞（CD3+） 淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+
剪成小块 PBS 洗2次
剪至浆状
制备仪
2-3min
300目尼龙网过滤
离心
剪碎法
1000r/min，5min
单细胞悬液。
吸管轻轻吹打
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 单细胞悬液。
醇乙脱水： 70％→80%→90％→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石 蜡包埋 脱蜡水化： 二甲苯脱蜡→ 100％醇乙 →90%→80%→70％→50％ →蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片
乙醇，蒸馏水
二甲苯脱蜡 胰蛋白酶
1-2天
水化
组织器官
37℃，15-30min
冰PBS 过滤 离心 液
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会， 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、 命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
六、荧光染色对照设臵(空白对照
同型对照 )
、阳性对照、阴性对照、
1、空白对照
用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板
胰蛋白酶
吸去培养液
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次
含血清的培养基
吹打
PBS洗2次
单细胞悬液。
3. 组织器官单细胞悬液的制备
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加
入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原--抗 体--抗体复合物。其操作复杂、费时，目前
兔抗小鼠
小鼠
很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直
接抗体，只能采用此方法。 直接标记是在标记时加入连接着荧光素
直
标
的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用
于各实验室。
根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内 抗
3. 对激光有强的吸收----降低背景噪音。
4. 激发光谱和发射光谱之间差距大---减少
干扰。
5. 易与被标记的物质结合，而不影响被标记 物的特异性。 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂 和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析：
双色分析：FITC与PE
三色分析：双色分析+PE-CY5
单细胞悬液
胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝
素液，臵于4℃ 冰箱中静臵 6-12h
尿 液：收集24h 尿液，臵4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内臵 6-12h
间
标
羊抗兔
五、荧光标记
主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一
二、流式细胞术的特点、优点
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个 细胞，甚至几万个细胞。
多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
七、荧光补偿
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误 差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
酶消化法
组织器官
机械法
单细胞制备仪 剪碎法 网搓法 研磨法
（1）、酶消化法
组织块洗去血液
37℃，15-30min
剪成小块
胰蛋白酶
100目 单
含血清的培养基 PBS 洗2次
钢筛网过滤
离心
300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
细胞悬液。
（2）、机械法
单细胞制备仪
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
激发光波长（nm ）
异硫氰酸（FITC） 488 发射波长(nm) 525（绿）
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大， 散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反 映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该 道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数； 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.