流式细胞术常见实验分析课件

结果分析
用488nm激发，黄光和绿光通道收集荧光信号，调补偿纠正绿色荧光（单体） 和黄色荧光（聚合物）的重叠部分。线粒体膜电位采用比例法，即根据绿色 荧光与黄色荧光阳性百分率之比。
Ratio=G.M./Y.M. 比值升高，膜电位降低，膜受损。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2.2 DNA含量检测与周期分析
2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法 2.2.2 S期特异性检测 2.2.3 M期特异性检测
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法
基本原理：
细胞周期与DNA含量变化极其FCM分析直方图
荧光补偿 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
AnnexinⅤ -FITC单染
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
优缺点：
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2.1.3 线粒体膜电位法
1.2 样本采集 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
edit WL
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
结果分析
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
——Guava原软件分析
H
A
W
Red-A
Red-A
Red-W
Red-W
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
在用第三方软件分析之前，请将流式结果按如下所示导出。
结果分析
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
基本原理：
线粒体膜电位下降是细 胞凋亡早期的一个标志 性事件。
JC-1：亲脂性阳离子荧 光染料，特异性地与线 粒体内膜结合，膜电位 高时呈聚合体，膜电位 低时呈单体。
正常细胞 凋亡细胞
488nm
+
-
+
-++
+
-+
590nm
488nm +
-+
529nm
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2. 四种常见流式细胞术
2.1 细胞凋亡的检测与分析
2.1.1 PI单染法 2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法 2.1.3 线粒体膜电位法
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. Guava easycyte 8HT 操作流程
2. 四种常见流式细胞术
❖ 细胞凋亡的检测与分析 ❖ DNA含量检测与细胞周期分析 ❖ 胞内活性氧水平的检测与分析 ❖ 细胞表面分子的检测与分析 ❖ 组合实验
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
凋亡启动
凋亡早期
凋亡晚期
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2.1.1 PI单染法
基本原理： • 正常细胞DNA含量：2n~4n • 凋亡细胞：核内DNA断裂，乙
醇固定后膜通透性增加，小片 段DNA穿膜丢失，胞内DNA含 量减少。PI染色后，荧光强度 减小而形成一个DNA含量小于 2n的分布区（亚G1峰）。
• 1.3 分析
见具体实验的分析。
• 1.4 关机
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1.5 日常维护
保持空气干燥，会使激光器的使用寿命长一些。 桌面不要有震动，以免光路发生偏移。 上机前检查废液瓶是否已满，若已满或将满请倒掉，用超纯水冲洗两
遍，放回原位；洗涤液瓶若已空或将空请补满（ICF：ddH2O=1：4）。 实验台面保持整洁，废物缸请及时倒掉。自己的东西实验后请收走，
磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素 Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合； PI是核酸荧光染料，不能透过正 常细胞膜，只能进入已经破损的 细胞膜。
正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+ 凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+ 坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
流式专用的物品请不要带走。 做完请记得登记。 每周在周一进行一次easycheck。
（自己在做实验之前也可进行easycheck，流程见下面。）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
easycheck
微珠：10μL（用前震荡混匀） Buffer：190μL
操作方法与结果分析见细胞周期部分。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
优缺点：
• 优点：简便，快捷，价廉，应用普遍。
• 缺点：
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法
基本原理：
1. Guava easycyte 8HT 操作流程 ——Incyte模块
1.1 开机-清洗
（原则：先开仪器后开软件，开机必清洗）
1.2 采集样本 1.3 分析 1.4 关机
（原则：先关软件后关仪器，关机前必清洗）
1.5 日常维护
1.1 清洗 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
文档仅பைடு நூலகம்参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
结果分析
阴性对照
PI
Annexin Ⅴ-FITC
PI/Annexin Ⅴ-FITC
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
荧光交叠
荧光补偿原理