生物工艺学第九章 动物细胞培养(细胞培养用生物反应器)
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长期分泌的细胞。
4 无泡搅拌反应器
一种装有膜搅拌器的生物反应器，采用多孔 的疏水性塑料管装配成通气搅拌桨，具有良 好的氧通透性。
由于这类反应器能提供动物细胞生长中所需 的容氧要求，产生的剪切力较小，以及在通 气中不产生泡沫，避免了在其他反应器中常 见的某些弱点，如泡沫等，已广泛用于实验 室研究、中试和工业生产。
微囊培养系统
原理：
在无菌条件下，将活性细胞或生物活性物质 悬浮在1.4%海藻酸钠溶液中，通过特制的成 滴器件含有细胞的悬浮液形成小滴，滴入氯 化钙溶液中，形成内含活细胞的凝胶小珠。
用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包裹小 珠，形成坚韧、多孔可通透的外膜。
营养物质和氧可通过膜孔进入囊内，细胞代 谢的小分子产物可排出囊外，分泌的大分子 产物，不能穿过膜孔，积聚在囊内。
（1）Spier笼式通气搅 拌生物反应器
※特点
¾可以避免在向培养基中通 气时气泡直接损伤细胞；
¾在采用微载体系培养时， 微载体不会被由于通气所产 生的泡沫囊夹在气液界面；
¾通过一个多孔的通气装置 在笼内通气以满足培养时溶 氧的需要。
（２）CelliGen笼式通气搅拌生物反应器
¾ CelliGen笼式通气搅拌生物反应器是Spier 笼式通气搅拌生物反应器的改进型。
Ö双层笼式通气搅拌器与控制系统、管路系统、蒸汽
灭菌系统组装成为完整的动物细胞培养装置 CellCul-20反应器
3 中空纤维管生物反应器
原理：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用 反应器内中空纤维的布置，提供细胞近似生理 条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。
优点： ① 占地空间少； ② 细胞产量高，细胞密度可达109数量级； ③ 生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于
大载体由海藻酸钠构成。在收集细胞时．可 用Na—EDTA和柠檬酸钠使细胞从凝胶中分 离出来。
特点：1操作控制方便，可随机取样检测；2 附着细胞密度高；3 消耗品价格低廉，产物 收获量大，经济效益明显。
大载体的制备过程如下：配制 50mmol/L氯化钙溶液。经蒸汽 高压灭菌后，由输入泵注入培 养器中1750mL。将收集的细 胞悬液体积25mL，注入到 930mL无菌低黏度的海藻酸钠 凝胶中充分混匀。通过喷珠装 置，由输入泵将细胞混合液根 据需要的速度喷珠于氯化钙溶 液中，使聚合携带细胞的大载 体其直径约2.6mm。喷珠结束 后，抽出氯化钙溶液，另注入 生理盐水洗涤2次，最后注入 2000mL的培养液进行气升式 悬浮培养。
扩增 检测
检测 细胞数 存活率 葡萄糖
pH
细胞培养
温度控制 通气
pH控制 搅拌
动物细胞培养生物反应器的要求
由于动物细胞没有细胞壁和对剪切敏感的特性， 动物细胞培养生物反应器的设计必须考虑以下要 求： \生物因素 \传质因素 \流体力学因素 \传热因素 \安全因素 \操作因素
（一）维持培养和放大培养
培养容器（实验室）
多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶：常用的静止培养 容器，体积小，操作方便，很易放入培养箱中。可由特 殊处理的塑料制成，后两者常由玻璃制成。
组织培养方瓶及操作
滚瓶（roller bottle）：培养时放在转瓶机上 缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培养。
优点：放大较容易，重演性好。
5 流化床和填充床反应器
流化床反应器的基本原理：使支持细胞生长 的微粒呈流态化。
培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提 供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微 粒中生长。
大载体系统
一种新型的大规模培养细胞装置，配有先进 的主要部件，如溶解氧、pH测定以及培养 液输入和产物的收获均由微机程控调节。
存在问题：由于液体混合的能量唯一来自通入的 气体，因而通气量大，泡沫多，而且气泡破碎造 成严重的细胞机械损伤。
2 通气搅拌生物反应器
根据动物细胞培养时要求剪切力小、 混合性能好的特点开发出来的生物 反应器；
主要有Spier笼式通气搅拌生物反 应器、CelliGen笼式通气搅拌生物 反应器和CellCul-20双层笼式通气 搅拌生物反应器。
动物细胞培养存在的问题
细胞密度低，细胞生产率低，产物浓度也很 低。
细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌 产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细 胞培养领域深感棘手的问题。
动物细胞培养基，培养设备以及培养用微载 体颇为昂贵，限制了细胞培养工程在发展中 国家的开展。
动物细胞培养发展的方向
总方向：大型化、自动化、精巧化、低成本、 高细胞密度、高目的产品产量。
\开发能高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞 系；
\开发细胞生长性能优良、解离细胞容易，并能重 复使用的新型廉价微载体；
\研制更大规模的高无菌条件的生物反应器和剪切 力小、混合性能良好的新型搅拌系统；
\传感器、自动控制技术的应用；
2. 器材：各种培养器皿；
3. 操作：实验操作无菌观念不强，技术不 熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等， 都可以造成污染；
4. 血清：有些血清在生产时就已经被支原 体或病毒等污染，变成了污染；
5. 组织样本：原代培养的污染多数来源于 组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻 底，可造成碘混入组织，细胞或培养液 中，影响细胞细胞生长。
第九章 动物细胞培养
¾概述； ¾细胞培养物的特性； ¾动物细胞培养用培养基 和培养方法； ¾动物细胞培养用生物反 应器。
动物细胞培养基本工艺：分为三个阶段（准备阶段、 细胞培养阶段和产物生产阶段）。
设备准备 清洗 烘干 安装 消毒
培养基制备 纯水制备 试剂准备
混合 除wk.baidu.com 检测
细胞准备 种子库建立 细胞复苏
\开发新型无血清培养基。
缺点：劳动强度大，比表面积小，占用空间 大，培养条件难以检测和控制
滚瓶
滚瓶机
转瓶（spinner bottle）：一般由磁力驱动进 行温和搅拌。
转瓶
转瓶机
生物反应器是动物大规模培养中最重要的培养设备。 动物细胞培养对培养容器的培养表面的要求：
\生物相容性； \具有较高的光洁度； \弱电荷和亲水性； \培养容器最好具有透光性。
特点：
1. 细胞密度大 2. 产物单位体积浓度高 3. 分离纯化操作经济简便 4. 抗体活性、纯度好
微载体培养系统
培养物的污染及防止
污染途径 ：
有以下5个污染途径。 1、空气：
空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不 严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造 成污染。
因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应 在净化台内进行，工作时要带口罩。
（二）生产用动物细胞反应器的形式
1、气升式生物反应器； 2、通气搅拌生物反应器； 3、中空纤维管生物反应器； 4、无泡搅拌反应器； 5、流化床和填充床反应器。
1.气升式生物反应器
优点：
¾ 结构简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了 污染的机会；
¾ 产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小； ¾ 放大容易； ¾ 直接通气供氧，氧传递速率高，供氧充分； ¾ 液体循环量大，细胞和营养成分混合均匀。
¾ CelliGen笼式通气搅拌生物反应器的通气装 置是将笼式通气搅拌装置改为笼式的通气腔 和笼式的消泡腔。
（３）CellCul-20双层笼式通气搅拌生物 反应器
改进：
在改变了气路系统使之能在线灭菌
采用具有静止密封的磁力驱动装置
将单层笼式通气搅拌器改为双层笼式通气搅拌器
\ 以扩大丝网交换面积 \ 提高单位面积产量
4 无泡搅拌反应器
一种装有膜搅拌器的生物反应器，采用多孔 的疏水性塑料管装配成通气搅拌桨，具有良 好的氧通透性。
由于这类反应器能提供动物细胞生长中所需 的容氧要求，产生的剪切力较小，以及在通 气中不产生泡沫，避免了在其他反应器中常 见的某些弱点，如泡沫等，已广泛用于实验 室研究、中试和工业生产。
微囊培养系统
原理：
在无菌条件下，将活性细胞或生物活性物质 悬浮在1.4%海藻酸钠溶液中，通过特制的成 滴器件含有细胞的悬浮液形成小滴，滴入氯 化钙溶液中，形成内含活细胞的凝胶小珠。
用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包裹小 珠，形成坚韧、多孔可通透的外膜。
营养物质和氧可通过膜孔进入囊内，细胞代 谢的小分子产物可排出囊外，分泌的大分子 产物，不能穿过膜孔，积聚在囊内。
（1）Spier笼式通气搅 拌生物反应器
※特点
¾可以避免在向培养基中通 气时气泡直接损伤细胞；
¾在采用微载体系培养时， 微载体不会被由于通气所产 生的泡沫囊夹在气液界面；
¾通过一个多孔的通气装置 在笼内通气以满足培养时溶 氧的需要。
（２）CelliGen笼式通气搅拌生物反应器
¾ CelliGen笼式通气搅拌生物反应器是Spier 笼式通气搅拌生物反应器的改进型。
Ö双层笼式通气搅拌器与控制系统、管路系统、蒸汽
灭菌系统组装成为完整的动物细胞培养装置 CellCul-20反应器
3 中空纤维管生物反应器
原理：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用 反应器内中空纤维的布置，提供细胞近似生理 条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。
优点： ① 占地空间少； ② 细胞产量高，细胞密度可达109数量级； ③ 生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于
大载体由海藻酸钠构成。在收集细胞时．可 用Na—EDTA和柠檬酸钠使细胞从凝胶中分 离出来。
特点：1操作控制方便，可随机取样检测；2 附着细胞密度高；3 消耗品价格低廉，产物 收获量大，经济效益明显。
大载体的制备过程如下：配制 50mmol/L氯化钙溶液。经蒸汽 高压灭菌后，由输入泵注入培 养器中1750mL。将收集的细 胞悬液体积25mL，注入到 930mL无菌低黏度的海藻酸钠 凝胶中充分混匀。通过喷珠装 置，由输入泵将细胞混合液根 据需要的速度喷珠于氯化钙溶 液中，使聚合携带细胞的大载 体其直径约2.6mm。喷珠结束 后，抽出氯化钙溶液，另注入 生理盐水洗涤2次，最后注入 2000mL的培养液进行气升式 悬浮培养。
扩增 检测
检测 细胞数 存活率 葡萄糖
pH
细胞培养
温度控制 通气
pH控制 搅拌
动物细胞培养生物反应器的要求
由于动物细胞没有细胞壁和对剪切敏感的特性， 动物细胞培养生物反应器的设计必须考虑以下要 求： \生物因素 \传质因素 \流体力学因素 \传热因素 \安全因素 \操作因素
（一）维持培养和放大培养
培养容器（实验室）
多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶：常用的静止培养 容器，体积小，操作方便，很易放入培养箱中。可由特 殊处理的塑料制成，后两者常由玻璃制成。
组织培养方瓶及操作
滚瓶（roller bottle）：培养时放在转瓶机上 缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培养。
优点：放大较容易，重演性好。
5 流化床和填充床反应器
流化床反应器的基本原理：使支持细胞生长 的微粒呈流态化。
培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提 供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微 粒中生长。
大载体系统
一种新型的大规模培养细胞装置，配有先进 的主要部件，如溶解氧、pH测定以及培养 液输入和产物的收获均由微机程控调节。
存在问题：由于液体混合的能量唯一来自通入的 气体，因而通气量大，泡沫多，而且气泡破碎造 成严重的细胞机械损伤。
2 通气搅拌生物反应器
根据动物细胞培养时要求剪切力小、 混合性能好的特点开发出来的生物 反应器；
主要有Spier笼式通气搅拌生物反 应器、CelliGen笼式通气搅拌生物 反应器和CellCul-20双层笼式通气 搅拌生物反应器。
动物细胞培养存在的问题
细胞密度低，细胞生产率低，产物浓度也很 低。
细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌 产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细 胞培养领域深感棘手的问题。
动物细胞培养基，培养设备以及培养用微载 体颇为昂贵，限制了细胞培养工程在发展中 国家的开展。
动物细胞培养发展的方向
总方向：大型化、自动化、精巧化、低成本、 高细胞密度、高目的产品产量。
\开发能高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞 系；
\开发细胞生长性能优良、解离细胞容易，并能重 复使用的新型廉价微载体；
\研制更大规模的高无菌条件的生物反应器和剪切 力小、混合性能良好的新型搅拌系统；
\传感器、自动控制技术的应用；
2. 器材：各种培养器皿；
3. 操作：实验操作无菌观念不强，技术不 熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等， 都可以造成污染；
4. 血清：有些血清在生产时就已经被支原 体或病毒等污染，变成了污染；
5. 组织样本：原代培养的污染多数来源于 组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻 底，可造成碘混入组织，细胞或培养液 中，影响细胞细胞生长。
第九章 动物细胞培养
¾概述； ¾细胞培养物的特性； ¾动物细胞培养用培养基 和培养方法； ¾动物细胞培养用生物反 应器。
动物细胞培养基本工艺：分为三个阶段（准备阶段、 细胞培养阶段和产物生产阶段）。
设备准备 清洗 烘干 安装 消毒
培养基制备 纯水制备 试剂准备
混合 除wk.baidu.com 检测
细胞准备 种子库建立 细胞复苏
\开发新型无血清培养基。
缺点：劳动强度大，比表面积小，占用空间 大，培养条件难以检测和控制
滚瓶
滚瓶机
转瓶（spinner bottle）：一般由磁力驱动进 行温和搅拌。
转瓶
转瓶机
生物反应器是动物大规模培养中最重要的培养设备。 动物细胞培养对培养容器的培养表面的要求：
\生物相容性； \具有较高的光洁度； \弱电荷和亲水性； \培养容器最好具有透光性。
特点：
1. 细胞密度大 2. 产物单位体积浓度高 3. 分离纯化操作经济简便 4. 抗体活性、纯度好
微载体培养系统
培养物的污染及防止
污染途径 ：
有以下5个污染途径。 1、空气：
空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不 严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造 成污染。
因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应 在净化台内进行，工作时要带口罩。
（二）生产用动物细胞反应器的形式
1、气升式生物反应器； 2、通气搅拌生物反应器； 3、中空纤维管生物反应器； 4、无泡搅拌反应器； 5、流化床和填充床反应器。
1.气升式生物反应器
优点：
¾ 结构简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了 污染的机会；
¾ 产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小； ¾ 放大容易； ¾ 直接通气供氧，氧传递速率高，供氧充分； ¾ 液体循环量大，细胞和营养成分混合均匀。
¾ CelliGen笼式通气搅拌生物反应器的通气装 置是将笼式通气搅拌装置改为笼式的通气腔 和笼式的消泡腔。
（３）CellCul-20双层笼式通气搅拌生物 反应器
改进：
在改变了气路系统使之能在线灭菌
采用具有静止密封的磁力驱动装置
将单层笼式通气搅拌器改为双层笼式通气搅拌器
\ 以扩大丝网交换面积 \ 提高单位面积产量