代谢组样本收集和储存

一、代谢组学研究内容
Environment Microbiome
What can happen?
What appears to be happening?
What makes it happen?
What has happened and is happening?
二、代谢组研究意义
Biomarker Discovery
粪便样本取样指南
小鼠/大鼠粪便样本的采集 p 将待取样的小鼠/大鼠放进干净的铺有消毒滤纸的笼子里，排便后立即用灭菌的镊子 夹到无菌冻存管中 p 小鼠粪便样本通常需要6-8粒，大鼠粪便样本1-2粒 p 若样本需要重复检测，可用无菌棒混匀后分装成几管，每管至少200 mg，避免反复
冻融 p 样本采集后立刻放入-80℃冰箱进行低温保存。
p 提前分装，避免反复冻融 p 避免尿液、容器等对粪便样本
的污染 p 尽可能保持样品处于厌氧环境 (如有条件可以使用厌氧袋) p 同一实验不同样本尽可能取同 段肠道内容物 p 样本-80度保存
粪便样本取样指南
人粪便样本的采集 p 将粪便排泄到干净的容器中，尽量避免尿液、马桶壁等对粪便样本的污染，取同段
2、血液样本的选择：血浆 or 血清？
p 整体而言，血清和血浆的代谢物种类差异不大，浓度差异较大 p 个体间代谢轮廓的差异性更大，血清和血浆样本均可应用于代谢组学研究 p 在同一项研究中要保持统一
ESI-
ESI+
GC-MS
血清和血浆样品分别作PCA后的叠加得分图
3、溶血的影响
细胞膜受损——血红蛋白和其他细胞成分包括代谢产物（蛋白、脂类、碳水化合物）以及酶释放。 溶血：游离血红蛋白浓度在300 mg/L（18.8mmol/L）；
10min，以最大程度保证血清质量; p 将血清分装，冻存于-80℃; p 干冰运输。
二、尿液样本的收集和储存
优势： p 无创取样，安全性高 p 易获取，样本量大，可重复 p 前处理操作简单 尿肽，蛋白量低，无需复杂前处理 p 代谢物浓度普遍高于血浆 p 代谢物种类丰富：氨基酸、脂 类、有机酸和核苷酸
四、组织样本的收集和储存
组织种类多样：心脏、肝、脾、肺、肾、胃、结直肠组织、大肠、小肠等
1、组织样本收集
p 肿瘤样本：病灶部位 +“正常”组织； p 代表性：取实验所需组织器官（剔除结缔组织，脂肪组织
等非必须组织）； p 异质性：采样位置在整个相同的实验中保持一致（避免区
域特异性代谢物差异，获得可重复的结果） p 污染：滤纸吸干残留血，生理盐水清洗； p 切片或均质时避免污染
三、代谢组学研究流程
实验设计
样本收集 储存和运输
样本前处理
数据采集
数据分析
血，尿，组织
SPE萃取柱
蛋白沉淀板 离心机
运输和储存
全自动样本前处理
Preanalytical phase
Q-Trap 6500
Triple-TOF 6600 Q-TOF 6545
KEGG
Analytical phase Postanalytical phase
四、规 范 代 谢 组 样 本 收 集 和 储 存 的 意 义
Postanalytical phase
11% 8%
Analytical
Preanalytical phase
81%
Postanalytical phase
6%
Analytical
24% 70%
Preanalytical phase
CC统计两年临床诊断误差数据占比
尿液样本取样指南
p 取标本前要洗手，以及实施其它必要的清洁措施； p 取尿液大于1mL，在4℃保存，静置； p 取1mL尿液进行离心分离(4℃，10000 rpm，离心5 min)； p 吸取上清液100uL分装于合适的已编号EP管中，如此重复分装成多管以避免反复冻融; p 液氮速冻，-80℃冰箱中保存。 注意事项 1）动物1 h尿量不够，可分多次收集；若要收取24 h尿液，使用低温装置的代谢笼收取， 及时冻存。 2）不建议添加如叠氮化钠等抑菌剂
Contents
Part 01 规范代谢组样本收集和储存意义
Part 02 代谢组样本收集和储存及其注意事项
Part 03 代谢组样本其他注意事项
Part 04 规范代谢组样本收集和储存总结
PART 01：规范代谢组样本收集和储存意义
一、代谢组学研究内容 二、代谢组学研究意义 三、代谢组学研究流程 四、规范代谢组样本收集和储存的意义 五、样本收集和储存不当造成实验结果失败案例
三、粪便以及肠道内容物的收集和储存
肠道菌群：机体代谢，疾病，免疫调节，营养等密切相关 主要研究对象：粪便和肠道内容物 p 粪便：平均每天产生128克(湿物质)，含有63-85%的水 p 干燥物组成：细菌(25-54%)、脱落上皮细胞、食物残渣、
大分子和小分子代谢物 p 无创取样，安全性高 p 肠道内容物：动物易获取，菌群真实性
2、各种类型组织样本取样建议
p 组织鲜样 取全部脏器或者有代表性的样本，或者研究部位分割成小 块，严格取相同段，分装，液氮速冻后-80度保存 p 组织匀浆液（手动，电动匀浆）： • 称重组织或器官（取等重量，或全部脏器） • 用3-4倍体积生理盐水（或者1：9）匀浆后分装 • 液氮速冻后-80度保存 p 冻干粉 p 其他 已固定过的组织样本（甲醛，多聚甲醛等等），有机溶剂 浸泡样本等等
室温：22度；实线：未处理；虚线：过滤
3、稳定性和反复冻融 不稳定原因：化学假说，细菌假说，酶假说，三种机制均存在，影响部分重叠
p 存储前有计划地将样品提前分装好，尽量避免反复冻融 p 4度，2h内快速处理（有条件的过滤+离心，除菌除蛋白，降低细菌和酶影响）； p 短期储存在-20°C或以下，长期储存在-80度
五 、 细 胞 （ ~2%）
取样时期，取样操作，细胞计数
六、其他
脑脊液，唾液，微生物，培养基等
一、血液样本的收集和储存
p 全血：稳定性差，异质性，制备方法相容性差； p 1000多种内源性小分子代谢物； p 代谢物种类多、极性跨度大； p 高极性：氨基酸、葡萄糖和核苷类； p 低极性：脂类和固醇类等
Analytical Preanalytical phase
2、血浆收集使用不同批样本管，重点关注物质，外源性引入
3、细菌污染，关注物质为细菌代谢产生
4、细胞保存缓冲盐浓度过高，析出结晶，上机过程出故障
A: 晶体重新溶解 ：4.6 mM B: 该项目样本： 2.288 mM C: 血浆： 0.198 mM
5、外泌体提取率低，提取平行性差，组内差异太大
样本量均值 RSD
A
105.60
109%
B
106.10
57%
C
111.90
48%
D
182.19
47%
四、规 范 代 谢 组 样 本 收 集 和 储 存 的 意 义
Postanalytical phase
11% 8%
Analytical
Preanalytical phase
6、其他注意事项
p 保证稳定性：尽快从全血制备血浆和血清 p 当全血样本无法立即处理时，应将其储存在4度下 p 保证一致性：凝血时间，温度保持一致 p 离心转速，时间，温度保持一致
血液样本取样指南
血浆 p 用采血针和抗凝管（含EDTA或其他抗凝剂）抽取全血，采血后立即轻轻颠倒混匀
采血管5-10次，以确保抗凝剂发挥作用; p 4℃条件下3000rpm离心10min-15 min（可根据试验方案进行适当调整），取上清
81%
Postanalytical phase
6%
Analytical
24% 70%
Preanalytical phase
CC统计两年临床诊断误差数据占比
p 分析前失误造成结果失误远高 于分析过程和后续数据处理；
p 实验样本引入的第一步； p 代谢组学研究结果可靠性的最
重要的环节之一 p 可重复和可信结果：高质量生
即为血浆; p 可将血浆分装，并冻存于-80℃; p 干冰运输;
血液样本取样指南
血清（不加抗凝剂或添加促凝剂） p 采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管; p 4℃下静置3-4小时，可见血块析出; p 5000 rpm，4℃离心10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000 rpm，4℃离
p 分析前失误造成结果失误远高 于分析过程和后续数据处理；
p 样本的收集是实验样本引入的 第一步；
p 代谢组学研究结果可靠性的最 重要的环节之一
p 可重复和可信结果：高质量生 物样品，质量控制
五：样本收集和储存不当造成实验结果失败案例
1、血浆样本加入添加剂，样本分组明显
Analytical Preanalytical phase
血浆：全血离心沉淀，不含细胞的液体，其中含 有纤维蛋白原 。 血清：已除去纤维蛋白。
10%5%
20% 65%
脂质 糖类 氨基酸 核酸
1、采血管的选择
p 柠檬酸（枸橼酸）：机体内重要代谢通路——三羧酸循环的中间产物 p 肝素(Na,Li)：质谱上有聚乙二醇[-CH2CH2O-]n 干扰 p EDTA (Na,K)：推荐使用 K+–EDTA采血管 p 促凝剂：可加速凝血，缩短血清暴露时间 p 使用相同的采血管：降低干扰，凝血、抗凝操作一致性
物样品，质量控制
PART 02：代谢组样本收集和储存
一 、 血 液 （ ~80%）
样本的选择，采血管的选择，溶血的影响，储存稳定性，反复冻融
二、尿液（7~8%）
样本选取，添加剂，储存稳定性，反复冻融
三 、 粪 便 、 肠 道 内 容 物 （ ~2 % ）
样本均Baidu Nhomakorabea化，储存稳定性
四、组织(~5%）
样本收集，不同类型组织样本取样
1、样本的均质化
p 收集的样本在分装前先混匀 不同部位菌群和代谢物分布不一样 p 粪便类型 粪水的一致性最高： 粪水结合（小极性代谢物损失）； 混匀后冻干（挥发性代谢物损失）； p 肠道内容物选取
内容物冲洗收集（等体积，少量多次） 直接刮取后混匀
2、稳定性及其它注意事项
p 没有条件立即速冻保存时，应 置于冰上；
样本或将所有样本混匀后再取样 p 用无菌勺对粪便进行挖取，将适量粪便样本放入无菌保存管中 p 样本需1g左右，对样本进行分装，以避免反复冻融 p 采集好的样本立刻放入-80℃冰箱进行保存。 注意事项 1）样本提供者近3个月内不可接受抗生素治疗。如在家中搜集样本，应该收集完成后 迅速放入速冻盒且1天内移到-80℃冻存。（短链脂肪酸检测样本唯一标准） 2）将粪便样本保存在95%乙醇溶液中，4天内将其移到-80℃冻存。 3）将粪便样本保存在干冰中，尽快转入-20℃冰箱保存。
Aging Inflammation/ Immunology
Infectious Diseases
Cardiovascular
Personalized Medicine
Cancer
样本类型
临床诊断的生物标志物发现和验证： 血液、尿液、粪便、唾液； 探索和解释疾病的病理机制研究：组 织和细胞； 检测菌群相关代谢物：粪便或肠道内 容物；
1、尿液选取
p 收集尿液的前一天饮食要清淡 p 随机，定时（晨起，晨间 1 h ），24h取样 p 特定研究时需考虑收集容器 p 取标本前要洗手，尿道清洁后取样（可减少
20%的假阳性），不建议使用洗涤剂 p 男，女性，儿童，中端尿（前部分细菌多）
2、添加剂 Yes or No？
p 新鲜尿液：少量细胞，晶体，细菌，真菌等； p 防腐剂：硼酸，叠氮化钠，NaF 有效抑菌，但促进样品中化学复合物的形成，或 导致样品处理一致性和样品整体质量问题； 硼酸：影响电喷雾电离 p 离心：(4℃，10000 rpm，离心 5 min) p 滤膜：0.2 um效果优于防腐剂，超滤
Tips：体外溶血可避免 快：及时分离血细胞； 准：取样作规范，避免血肿部位；
分离的转速、时间和温度要适当；
*
柔：避免剧烈震荡，运输规范
4、稳定性
-80℃ 14–19 months ( , n =17) 20–30 months ( , n =21)
p 7天及以上，建议保存-80度； p -80℃下长期保存人血浆样本，也会导致代谢物浓度的统计显著变化，建议不超过两年； p 使用干冰运输； p 生物标志物，应根据代谢物的时间依赖性规律来考虑和消除样品不稳定性的变化；
5、反复冻融
冻融影响：将超低温冰箱或液氮中的生物样本直接放置到
室温环境，代谢物氧化降解或代谢酶活性恢复的时间差异，
会引起代谢物组成和浓度的变化。 p 存储前有计划地提前分装，尽量避免反复冻融； p 反复冻融不超过4次； p 重新冷冻之前，逐步解冻并将样品保持在4°C； p 尽量使用来自同一冻融循环的样本